猪重要病毒性病原多重PCR检测方法建立及应用

王朋冲，姜艳芬，周宏超，李春燕，李鑫鑫，罗丽华，冯 秀，郭抗抗

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100)

目前对养猪业危害最大的主要是病毒性传染病，常见的病原有猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)，伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等。CSFV引发的猪瘟(CSF)是猪的一种高度传染性病毒性疾病，传染性强、死亡率高、经济损失大[1-2]；PPV能引起母猪产死胎、弱胎、木乃伊胎，感染猪场会经常出现母猪繁殖失败的现象[3]。PRV、PCV2、PRRSV除了导致感染发病猪死亡外，还会造成猪群隐性感染，猪群长期带毒[4]。临床上准确检测这些病毒是对其有效防控的基础，目前猪群很少存在单一病原感染的情况，多种病原的混合感染或继发感染较为常见[5-6]。病毒检测常用的实验室方法有病毒的分离鉴定、血清学检测、免疫学检测、分子生物学检测等。分子生学技术由于具有快速、操作简单、结果可靠、敏感性高等优势，在畜禽病毒检测中广泛应用，应用最多的是聚合酶链式反应(PCR)技术，以及在其基础上发展产生的各项技术，如反转录PCR、多重PCR、实时定量PCR等[7]。多重PCR技术就是在一个反应体系中加入针对不同病原的特异性引物，可以实现一个反应检测多个病原的目的，具有高通量检测的优势而被广泛的应用于病原的检测[8-9]。

在猪场疾病防控和调研工作中，我们发现一些猪场存在多种病毒感染的情况，主要有CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV，需要建立快速、敏感的检测方法。结合对猪场病毒性病原感染情况的调查，针对猪场和基层单位技术能力，分别建立了核酸为RNA的CSFV和PRRSV的双重RT-PCR检测方法，核酸为DNA的PCV2、PRV和PPV的三重PCR检测方法，为这些病毒的快速、大批量检测提供了可供选择的方法。

1 材料与方法

1.2 病毒和血清样品 猪瘟病毒石门株灭活毒、PRRSV美洲株、PRV、PPV、PCV2、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均由西北农林科技大学动物医学院兽医公共卫生学科研实验室提供。陕西省部分猪场血淸118份，可分为陕南地区58份、陕北地区30份、关中地区30份。-80 ℃保存。

1.3 方法

1.3.1 引物的设计与合成 从GenBank上下载CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV的不同来源分离株全基因序列，通过DNAStar软件对各种病毒的分离株序列进行比对分析，选择不同病毒保守的基因序列。以筛选的病毒保守序列为模板，用Primer5软件分别设计了这5种病毒的特异性引物。引物由华大基因科技服务有限公司合成。引物信息见表1。

1.3.2 病毒核酸提取和cDNA合成 按照TIANGEN公司DNA提取试剂盒说明书操作，分别提取PCV2、PRV和PPV等3种病毒细胞培养物的总DNA。用TRIZol法分别提取CSFV和PRRSV细胞培养物中的总RNA，用Thermo Fisher Scientific反转录试剂盒对所提取的RNA进行反转录，合成cDNA。

表1 所用引物序列

1.3.3 CSFV和PRRSV双重RT-PCR方法的建立

1.3.3.1 CSFV、PRRSV cDNA的PCR扩增 以合成的CSFV、PRRSV的cDNA为模板，分别建立扩增CSFV、PRRSV的PCR方法。PCR反应体系为20 μL：包括2×TaqMasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物各1 μL(终浓度均为0.25 pmol/μL)，cDNA 1 μL。PCR扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 45 s；72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。取10 μL PCR产物进行琼脂糖电泳后观察结果。将获得的符合预期大小的条带进行胶回收，与pMD19-T载体连接，阳性质粒送华大基因科技服务有限公司(北京)测序。

1.3.3.2 CSFV和PRRSV双重PCR反应条件的筛选 首先确定最适的双重PCR退火温度，PCR反应体系为20 μL：包括2×TaqMaster Mix 10 μL，ddH2O 5 μL，CSFV和PRRSV上、下游引物各1 μL(终浓度0.25 pmol/μL)，cDNA 1 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；退火温度分别设定为54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃，45 s；72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。取10 μL PCR产物进行琼脂糖电泳，观察结果。

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在确定双重PCR最适退火温度的基础上，对引物最适终浓度进行筛选。反应体系及条件同前，将每条引物的终浓度分别调整为0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL，进行PCR扩增，筛选出最适引物使用量。

1.3.3.3 双重PCR的特异性和敏感性 分别以CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的cDNA，PRV、PCV2、PPV的DNA为模板，按照确定的CSFV和PRRSV双重PCR条件进行扩增，以检测方法的特异性。

调整两种病毒cDNA含量相同后取等体积混合，依次进行10倍倍比稀释，以建立的CSFV和PRRSV双重PCR条件进行扩增，评价方法的敏感性。

1.3.4 PCV2、PRV和PPV三重PCR方法的建立

1.3.4.1 PCV2、PRV和PPV单重PCR检测 PCR反应体系为20 μL：包括2×TaqMaster Mix 10 μL，RNase-free ddH2O 6 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 45 s；72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。取10 μL PCR产物进行琼脂糖电泳，观察结果。

1.3.4.2 PCR扩增产物的鉴定 将获得的符合预期大小的条带进行胶回收，按1.2.3.1的方法进行回收产物的测序鉴定。

1.3.4.3 三重PCR扩增体系的建立 分别以每种病毒的DNA、三种病毒组合的DNA为模板，通过对反应条件的优化，将3对引物以0.25 pmol/μL的终浓度混合加入20 μL PCR反应体系中，分别以54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃的退火温度，保持其他条件不变进行PCR扩增，筛选出最佳退火温度。在另一PCR反应体系(20 μL)中，将3对引物终浓度分别设定为0.2 pmol/μL、0.25 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL，并按照确定的最佳退火温度，保持其他试剂及反应条件不变进行PCR扩增，筛选出最佳引物浓度。

1.3.4.4 三重PCR反应的特异性和敏感性 分别以PCV2、PRV、PPV的DNA，PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV的cDNA为模板，按照确定的最佳三重PCR反应条件进行PCR扩增，评价方法的特异性。

调整3种病毒cDNA含量相同后取等体积混合，依次进行10倍倍比稀释，以建立的PCV2、PRV和PPV三重PCR进行扩增，评价方法的敏感性。

1.3.5 临床样品的检测 用建立的双重PCR和三重PCR方法分别对采集的118份猪血清样品进行CSFV、PRRSV及PCV2、PRV和PPV的检测。

2 结果

2.1 不同病毒单重PCR检测方法的建立 分别用设计的CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV特异性引物、模板，建立了分别检测这5种病毒的RT-PCR和PCR方法。在CSFV中可以扩增出大小约438 bp的目的条带，在PRRSV中扩增出大小约535 bp的目的条带，见图1。在PCV2、PRV和PPV中分别扩增出大小约880 bp、213 bp和295 bp的目的条带，见图2。将扩增产物纯化后测序，结果显示,均为特异性的条带(测序结果未显示)。

图1 CSFV和PRRSV的PCR产物电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:PRRSV；2:CSFV；3-4:阴性对照

图2 PCV2、PRV和PPV的单重PCR产物电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:PCV2；2:PRV；3:PPV；4-6:阴性对照

2.2 CSFV和PRRSV双重PCR的最佳条件 通过对双重PCR不同退火温度下条带的观察，确定CSFV和PRRSV双重PCR最适退火温度为62 ℃(图3)。引物的终浓度为0.4～0.5 pmol/μL时，PCR产物量最大且基本一致，故选择引物的终浓度为0.4 pmol/μL(图4)。

图3 退火温度优化的双重RT-PCR产物电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:54 ℃；2:56 ℃；3:58 ℃；4:60 ℃；5:62 ℃；6:阴性对照

2.3 CSFV和PRRSV双重PCR的特异性和敏感性 用建立的双重PCR方法分别检测CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、PRV、PCV2、PPV。结果显示，从CSFV和PRRSV中扩增出与预期大小一致的目的条带，其余病毒未扩增出产物(图5)。双重PCR的敏感性结果显示，CSFV的cDNA最低检测量为7.5 pg/μL，PRRSV为14.2 pg/μL(图6)。

图4 引物浓度优化的双重RT-PCR产物电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:阴性对照；2:0.2 pmol/μL；3:0.3 pmol/μL；4:0.4 pmol/μL；5:0.5 pmol/μL

图5 特异性扩增的双重PCR产物电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:CSFV和PRRSV基因双重RT-PCR扩增；2:PRV；3:PCV2；4:PPV；5:PEDV；6:TGEV；7:阴性对照

图6 敏感性扩增双重的PCR产物电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1-6:模板稀释度分别为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5；7:阴性对照

2.4 PCV2、PRV和PPV三重PCR的建立 在退火温度为56℃，PCV2和PRV的引物终浓度为0.2 pmol/μL，PPV的引物终浓度0. 3 pmol/μL时进行三重PCR扩增，可获得PCV2、PRV和PPV清晰的3条特异性条带，大小分别为880 bp、213 bp、295 bp，见图7。

图7 PCV2、PRV和PPV的三重PCR产物电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:三重PCR扩增；2:PCV2的PCR扩增；3:PPV的PCR扩增；4:PRV的PCR扩增 ; 5:阴性对照

2.5 检测PCV2、PRV和PPV三重PCR的特异性和敏感性 用建立的三重PCR方法分别检测CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、PRV、PCV2、PPV。结果显示，仅从PCV2、PRV、PPV的模板中扩增出与预期目的条带大小一致的产物，从其他病毒中均未扩增出产物(图8)。

图8 特异性扩增的三重PCR电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:PCV2、PRV和PPV基因三重PCR扩增；2:CSFV；3:PRRSV；4:PEDV；5:TGEV；6:阴性对照

敏感性结果显示，建立的三重PCR方法对PCV2的DNA最低检测量为6.9 pg/μL，PRV的最低检测量为9.2 pg/μL，PPV的最低检测量为8.6 pg/μL(图9)。

图9 敏感性扩增的三重PCR电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1-4:模板稀释度分别为10-3、10-2、10-1、100；5:阴性对照

2.6 临床样品的检测 用建立的双重RT-PCR和三重PCR方法分别对猪血清样品进行病毒检测。其中从陕南猪场58份样品中5种病毒的检出率分别是，CSFV为5.17%(3/58)，PRRSV为29.31%(17/58), PCV2 为10.34%(6/58), PRV为20.69%(12/58),PPV 为0%(0/58)；从陕北猪场30份样品中5种病毒的检出率分别是CSFV 为3.33%(1/30)，PRRSV 为3.33%(1/30)，PCV2为 26.67%(8/30), PRV 为36.67%(11/30)，PPV 为0%(0/30)；从关中猪场30份样品中5种病毒的检出率分别是, CSFV为3.33%(1/30)， PRRSV 为26.37%(8/30)， PCV2 为13.33%(4/30)， PRV为 13.33%(4/30)，PPV为0%(0/30)，部分样品检测电泳图见图10和图11。临床样品检测中PPV均为阴性，为了进一步验证三重PCR方法的敏感性，对样品再次进行了PPV的单重PCR。结果均未检测到PPV，部分样品PPV单重PCR见图12。

图10 部分临床样品CSFV和PRRSV双重RT-PCR产物电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1-6:临床样品；7:阳性对照

图11 部分临床样品PCV2、PRV和PPV三重PCR电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:阳性对照 ; 5-6:临床样品

3 讨论

随着我国养猪业的规模化程度的不断提高，养殖密度的加大，也为疾病的传播和发生创造了条件，给养猪业带来了巨大的疫病风险。目前，猪场出现的传染性疾病，由单一病原引起的较少，混合感染比较多见，使得临床上的表现复杂化，给疾病诊断带来了挑战和困难。病原的早发现是制定有效防控措施、防止疾病发生的基础，敏感、准确、快速、可操作性强的检测方法是及早确定病原，采取有效措施的有效工具。

图12 部分临床样品PPV检测的单重PCR电泳图

M:DNA标准DL-2 000；1:阴性对照；2:阳性对照；3-5:临床样品

病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫学技术、血清学技术、分子生物学技术等，这些技术检测方法在特异性、敏感性以及时效性等方面都有各自的优缺点[10-14]。分子生物学技术主要是基于核酸扩增的PCR技术，目前已成为动物疫病检测和诊断中最常用的方法，并由此衍生出多种基于PCR的技术，多重PCR技术可以同时检测多种病原，在生产上得以广泛应用[15]。本研究对当前养猪业危害较大的5种病毒为检测目标，通过对各种病毒参考毒株序列的同源性分析，选择其保守基因片断设计引物，分别建立了检测核酸类型为RNA病毒的多重RT-PCR检测方法，核酸类型为DNA病毒的多重PCR检测方法。经过对多重PCR体系、引物的使用浓度、反应条件、敏感性、特异性的不断优化，分别建立了检测CSFV和PRRSV的双重RT-PCR，检测PCV2、PRV和PPV的三重PCR方法。所建立的方法对CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV核酸的检出量分别为7.5 pg/μL、14.2 pg/μL、6.9 pg/μL、9.2 pg/μL和8.6 pg/μL。为了检验方法的可用性，用所建立的方法对猪场送检的118份猪血清进行了检测，为了确保检测的准确性，对获得的各种病毒特异性PCR产物进行纯化回收和序列测定，同时用待检病毒特异性RT-PCR或PCR方法进行复检，结果显示，所建立方法的特异性良好，可以用于临床检测。在样品检测中，分别检测到了CSFV、PRRSV、PCV2和PRV，但是未检测到PPV。可以看到CSFV、PRRSV、PCV2和PRV在猪场的感染率还较高，并且形成了病毒血症，需要引起高度关注，及时采取措施予以防控。在118份血清中未检出PPV，但并能完全确定猪群中不存在PPV的污染情况，只是未形成毒血症，所以对PPV的检测还要结合临床症状观察，选择组织样品作为检测材料进行病毒检测。

在随后的研究中我们还要对建立方法的临床上进行大范围应用，进一步优化，进行试剂盒的组装，为这些病毒的检测提供可应用的方法和产品。