GNPS指导下濒危药材重楼微生物次生代谢产物的研究

汪玉梅，胡金姗，吴爱芝，卢静容，范倩，张译心，荣莉，张翠仙

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

重楼为百合科植物云南重楼Parispolyphyllasmith varyunnanensis(Franch.) Hand-Mazz或七叶一枝花Parispolyphyllasmith varchinese(Franch.) Hara的干燥根茎[1-2]，是濒危中药材。由于重楼疗效显著，一直被医家推崇。重楼性微寒，味苦，有小毒，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效。目前，普遍认为重楼的药效成分为重楼皂苷类成分[3-4]。市场上流通的含有重楼的中成药产品有云南白药、芪珍胶囊、肝复乐胶囊等，主要用于治疗暑湿感冒、恶寒发热、头痛无汗、腹痛吐泻、水肿、小便不利[1]。由于市场对重楼需求旺盛、无序采挖等，导致重楼野生资源濒临枯竭状态，市场价格不断攀升(目前为1.9元/g)，重楼资源匮乏。针对以上问题，有学者提出从微生物角度进行资源保护[5]。目前，共有69个菌属超过800种内生微生物被研究[6]，但未见关于重楼皂苷或其直接相关次生代谢产物的研究报道。

GNPS(Global Natural Products Social Website)是新兴的可视化分子网络，对复杂体系的物质基础给予“可视性”提示[7-9]，广泛应用于药物发现、代谢、医学等领域复杂体系的分子预测。GNPS的特点是可以通过天然物的二级质谱特征将天然物中具有相似二级质谱的成分聚集在一起，形成分子笼，且不同的母离子构建成形状、尺寸和颜色意味着不同的化合物簇[10]。目前，GNPS已经收录了22 644个化合物和235 850个谱图[9]，可以快捷、可视、简便的用于指导天然物的分离，尤其是在结构新颖化合物的发现中具有明显优势。如，黄璐琦等[11]采用分子网络对传统中药天麻的化学成分进行研究，发现了152个化合物，其中70个化合物是新化合物；同时还对云南重楼和七叶一枝花的成分进行预测，共鉴定146个成分，新结构42个[12]。本研究旨在通过对重楼内生及根际土壤相关的微生物的研究，建立重楼微生物次生代谢产物的指纹图谱和GNPS网络，并对其化学成分进行初步预测，以期找到与宿主重楼相同或相近次生代谢产物的微生物，从而更有效地保护这一濒危药材，为重楼的资源保护提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SW-CJ-1FD单人单面超净工作台(苏州净化设备厂)；LX-B75L高压灭菌锅(合肥华泰医疗设备有限公司)；HYG-A电热恒温摇床(太仓市试验设备厂)；AUY120电子分析天平(广州湘仪机电设备有限公司)；Sartorius赛多利斯十万分之一天平(季尔国际贸易有限公司)；XHRE-2000A旋转蒸发仪(上海霄汉实业发展有限公司)；SHZ-DⅢ真空水泵(河南巩义予华仪器有限公司)；XHDLSB-5/25低温冷却液循环泵(上海霄汉实业发展有限公司)；AB SCIEX Triple TOFTM 5600+四级杆-飞行时间串联质谱(美国AB SCIEX公司)。

1.2 试剂

乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(分析纯，广州东巨精细化工有限公司)；甲醇(GR，上海迈瑞尔科技有限公司)；GF254型硅胶(青岛海洋化工厂)；AlCl3、H2SO4-EtOH、香草醛浓硫酸、KOH、FeCl3及KBiI4显色剂(实验室自制)；TLC硅胶板(自制)。

重楼皂苷Ⅰ(C-036-151122，CAS：50773-41-6)、重楼皂苷Ⅱ(C-037-160623，CAS：76296-72-5)、重楼皂苷Ⅵ(C-038-160126，CAS：55916-51-3)和重楼皂苷Ⅶ(C-039-160623，CAS：76296-75-8)对照品均购买自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 重楼

处于营养生长期的健康重楼，于2017年12月31日采自贵州六盘水，经广州中医药大学中药学院彭光天博士鉴定为重楼属百合科云南重楼正品(Parispolyphyllavar.yunnanensis，样品编号为RP，保存在广州中医药大学中药学院中药质量标准及天然药物实验室)。同期采集同根植株的根(样品编号为RP-R)、根状茎(样品编号为RP-Rh)、茎(样品编号为RP-S)、叶(样品编号为RP-L)、根际土壤(样品编号为RP-I)，用无菌袋装好后送至实验室，低温保存备用。样品得到后2 h内进行内生菌及根际土壤相关的微生物的分离。

1.4 培养基

微生物分离及发酵用培养基见表1和表2。

表1 微生物分离用培养基成分组成(1 L)Table 1 Composition of medium for the microorganisms isolation (1 L)

表2 微生物发酵用培养基成分组成(1 L)

Table2Composition of medium for the microorganisms fermentation (1 L)

培养基组成配方PDA葡萄糖(2.0%)、马铃薯(200.0 g)、蒸馏水1 000 mL。GPY葡萄糖(1.0%)、酵母膏(0.2%)、蛋白胨(0.1%),蒸馏水1 000 mL。真菌一号山梨醇(5.0%)、麦芽糖(4.0%)、味精(1.0%)、色氨酸(0.05%)、酵母膏(1.3%)、MgSO4·7H2O(0.03%)、KH2PO4(0.05%),蒸馏水1 000 mL。黄豆黄豆粉100.0 g,蒸馏水200.0 mL。大米大米100.0 g,蒸馏水200.0 mL。

2 方法

2.1 重楼微生物的分离纯化

将重楼叶、茎、芽、根、根状茎按以下流程进行表面消毒：无菌水漂洗3次(1 min/次)→体积分数75%乙醇浸泡3 min→质量分数2.0%次氯酸钠浸泡1 min→无菌水漂洗3次(1 min/次)[13-14]。最后一次漂洗所得的无菌水作为空白对照。消毒好的部位作为内生微生物分离备用。

取表皮消毒的重楼部位放入无菌研钵中研磨，吸取研磨液(原液)100 μL于EP管中，依次用无菌水分别稀释10-1和10-3；分别取10-3和10-1稀释液及原液进行平板涂布，每块平板40 μL。取重楼根际土壤于EP管中溶于无菌水，用无菌水稀释10-1和10-3，取10-3和10-1稀释液进行平板涂布，每块平板40 μL。不同重楼部位的不同浓度与土壤溶液的不同浓度分别在PDA、A1、CMM和M102培养基上各涂布2块平板(无菌水1块)。每种培养基各做1块空气空白平板，密封培养皿，贴好标签后放入28.0 ℃培养箱重静置培养。待以上固体培养基上长出菌落后，对比挑选生长状态不同的菌落，用接种环将菌落挑起，于与原固体培养基相同的平板上划线纯化(“之”字形)，使菌落逐步稀释。整个过程在超净工作台上完成，密封培养皿，放入28.0 ℃培养箱重静置培养。观察菌落生长状况。待平板上生长出单菌落之后，用接种环将菌落挑起，放入菌种保存管中(须高压灭菌)，加入40%甘油和原液体培养基体积比为1∶1约1 mL密封保存，-80 ℃冰箱保存菌株，保存菌种待用。

2.2 目标菌种的鉴定

将菌种管从冰箱取出解冻后用接种环蘸取适量的菌液，接种到含有固体培养基的平板上，每种菌分别接种到琼脂平板培养基上，置恒温培养箱中28 ℃培养3～5 d，待平板长出单菌落后，在显微镜下观察，对比其生长状态及形态，挑选与保存前形态一致的菌落，采用微生物基因组测序方法(ITS及D1/D2)进行菌种鉴定[15-17]。

2.3 重楼微生物提取液的制备

2.3.1 不同培养基的发酵培养 根据菌种鉴定结果以及对菌株目前化学成分研究现状的文献总结，挑选其中具有典型特征的菌株：RP-I-2、RP-I-3、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3和RP-S-4，用接种环分别挑取目标菌株平板上长出的单菌落接种到装有50 mL相应液体培养基的100 mL锥形瓶中，在28 ℃的CO2恒温培养箱中(165 r/min)培养2～3 d，获得目标菌株的种子培养液。吸取不同种子液(3.0 mL)分别加入不同的液体或固体培养基(1 L发酵瓶)进行发酵培养，每种培养基分别发酵2.0 L。

真菌在28 ℃下静置培养60 d；细菌于28 ℃摇床上(165 r/min)培养7 d；分别与空白培养基对比观察是否有明显的菌株生长，成长完毕加入甲醇(5 mL)停止发酵。

2.3.2 微生物次生代谢产物提取

2.3.2.1 细菌液体培养物 发酵完毕的细菌经离心得到菌体和菌液。菌液浓缩至200 mL，依次经等体积的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，有机相减压浓缩得EtOAc-1相和n-BuOH-1相。菌体经甲醇重复浸泡(24 h/次、共3～5次)，甲醇液减压浓缩得甲醇提取物，水捏溶至200 mL，依次经等体积的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，有机相减压浓缩得EtOAc-2相和n-BuOH-2相。4株细菌共得到10个EtOAc提取物和9个n-BuOH提取物(见表3)，备用。

表3 不同培养基培养不同菌种得到的提取物的质量

Table3Weight of different extracts of 7 strains from different mediam/mg

培养基RP-I-4(真菌)ABRP-I-2(真菌)ABRP-I-3(真菌)ABRP-L-1ABRP-L-2ABRP-L-3ABRP-S-4ABPDAC598.5150.136.0191.21 312.21 797.051.9435.320.6181.4165.0383.172.9112.4D331.3888.1189.4295.01 337.1235.6769.882.8918.086.31 357.4220.9GPYC397.0339.6315.1385.8243.6250.624.4167.8D694.0460.9143.81 005.4484.0182.722.9249.8真菌一号C324.9408.7475.0753.7188.5144.0D979.0716.8702.1175.1769.2黄豆2 495.13 089.03 683.4350.5大米19 493.012 540.2897.2

注：A代表EtOAc； B代表n-BuOH； C代表菌(丝)体； D代表菌液。

2.3.2.2 真菌液体培养物 发酵完毕后经甲醇灭活后的发酵物经纱布过滤得到菌丝体和菌液。菌液浓缩至200 mL，依次经等体积的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，有机相减压浓缩得EtOAc-1相和n-BuOH-1相；菌丝体经甲醇重复浸泡(24 h/次、共3～5次)，甲醇液减压浓缩得甲醇提取物，将提取物加水混悬至水溶液状态(200 mL)，依次经等体积的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，有机相减压浓缩得EtOAc-2相和n-BuOH-2相。3株真菌共得到18个EtOAc提取物和18个正丁醇提取物(见表3)，备用。

2.3.2.3 黄豆、大米培养基培养物 将发酵完毕后的固体培养基用乙酸乙酯[(500 mL/(瓶·次)]振摇提取3次，乙酸乙酯提取液减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏。共得到7个EtOAc提取物(见表3)，备用。

2.4 重楼微生物次生代谢产物指纹图谱研究

2.4.1 供试品溶液的制备 将表3中得到的提取物分别精密称取适量，置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成终质量浓度为0.10 g/mL的供试品溶液，备用。

2.4.2 对照品溶液的制备 分别精密称取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，置于1 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.4.3 TLC指纹图谱的建立[13，18]分别用0.5 μL的点样管吸取“2.4.1”项中的EtOAc相和n-BuOH相样品，点于不同硅胶薄层板上，分别选取最优展开体系PE-EtOAc(体积比2∶1)、PE-CH3OH(体积比9∶2)进行展开，取出，晾干。观察条件分别为：EtOAc相，自然光、紫外灯(254 nm和365 nm)、H2SO4-EtOH(显色后置自然光和紫外灯365 nm下检视)、香草醛浓硫酸和KOH显色剂；n-BuOH相，自然光、紫外灯(254 nm和365 nm)、H2SO4-EtOH(显色后置自然光、紫外灯254 nm和365 nm下检视)。

2.4.4 LC-MS指纹图谱的建立[9,13,19]

2.4.4.1 样品 取“2.4.1”项下正丁醇及固体培养基培养条件下样品200 μL用于LC-MS测试用。

2.4.4.2 UPLC条件 流动相为ACN-H2O(0～5 min，10%～30%ACN；5～23 min，30%～90%ACN；23～28 min，100%ACN)；流速为0.7 mL/min；进样量为3 μL；柱温为30 ℃；色谱柱为Phenomenex(5 mm，4.6 mm×100 mm)。将配制好的样品于Triple TOF TM5600+质谱系统进行检测。

2.4.4.3 MS条件 离子喷雾电压：4 500 V；离子源温度：550 ℃；碰撞能量：45 eV；扩散碰撞能量：15 eV；去簇电压：100 V；雾化器压力：379 kPa；辅助气压力：379 kPa；气帘气压力：241 kPa；飞行时间质谱(TOF-MS)分子量扫描范围：100～2 000。

2.4.5 GNPS分子网络建设及数据处理 将“2.4.4”项下的正丁醇相及固体培养基培养条件下菌株次生代谢产物中选取28个样品的二级质谱文件通过MSConvert软件转换后利用FileZilla FTP Client连接器导入GNPS分子网络平台(http://gnps.ucsd.edu)，分别建立分子网络图谱，并与混合对照品和谱库中的数据进行匹配；数据分析在Cytoscape软件中进行。

3 结果与分析

3.1 重楼微生物的分离与鉴定

本文从重楼中共分离得到32株微生物，结果见表4。

3.2 重楼微生物菌种鉴定

对菌株的菌(丝)体颜色、形状等进行观察，选择其中比较有特色的14株进行菌种鉴定，结果显示：RP-S-1和RP-S-6为假单胞菌属(Pseudomonas，种未鉴定)，RP-S-3、RP-L-2和RP-L-3均为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas，种未鉴定)，RP-I-2、RP-I-3和RP-I-4均为篮状菌属(Talaromyces，种未鉴定)，RP-S-2为红酵母属Rhodotorulasp.，RP-S-4为芽孢杆菌属Bacillussp.，RP-S-5为细杆菌属Microbacteriumsp.，RP-L-1为寡养单胞菌属Stenotrophomonassp.，RP-L-4为贪噬菌属Variovoraxsp.，RP-I-1为Saitozymasp.。genbank提交序列号为：SUB5958782 RP-I-1，MN176340；SUB5958782 RP-I-2，MN176341；SUB5958782 RP-I-3，MN176342；SUB5958782 RP-I-4，MN176343；SUB5958782 RP-S-2，MN176344；SUB5958805 RP-L-1，MN177117；SUB5958805 RP-L-2，MN177118；SUB5958805 RP-L-3，MN177119；SUB5958805 RP-L-4，MN177120；SUB5958805 RP-S-1，MN177121；SUB5958805 RP-S-3，MN177122；SUB5958805 RP-S-4，MN177123；SUB5958805 RP-S-5，MN177124；SUB5958805 RP-S-6，MN177125。

3.3 重楼微生物代谢产物分析

3.3.1 不同菌株次生代谢产物的TLC指纹图谱 在不同培养基、不同发酵时间对菌株RP-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4进行小规模发酵，得到各菌株的乙酸乙酯相TLC指纹图谱见图1，正丁醇相TLC指纹图谱见图2。从图可见：重楼相关微生物的次生代谢产物显色丰富；硫酸乙醇显色效果较明显，未显色时365 nm下的蓝绿色斑点显色后为鲜绿色，日光下有黄色及紫色斑点，365 nm下为黄色及粉红色，推测可能存在皂苷及酚酸类化合物；香草醛浓硫酸显色效果亦较明显，有蓝紫色、蓝绿色、黄色及黑色斑点，可能存在甾体及苯丙素类化合物；KOH显色后，原来的橙红色斑点变为紫色/紫红色，可能存在蒽醌类化合物。

表4 重楼不同部位的微生物种类及数量Table 4 Microbial species and quantities obtained from different parts of Paris polyphylla

365nm254nm自然光观察365nm自然光乙酸乙酯显色观察香草醛浓硫酸显色观察现象现象KOH显色现象

注：展开条件为PE-EtOAc(体积比2∶1)，菌株次生代谢产物点样顺序为RP-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4 [RP-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1中点样顺序为PDA(菌丝体、菌液、空白)、GPY(菌丝体、菌液、空白)、真菌一号(菌丝体、菌液、空白)、大米(EtOAc，空白)、黄豆(EtOAc，空白，PE，空白)；RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4点样顺序为PDA(菌丝体、菌液、空白)]。

图1 7种菌株次生代谢产物的乙酸乙酯相TLC指纹图谱Figure 1 TLC fingerprints of Ethyl acetate phase of secondary metabolites of 7 strains

注：展开条件为PE-CH3OH(体积比9∶2)，菌株次生代谢产物点样顺序为RP-I-2、RP-I-4、RP-I-3、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4[RP-I-2、RP-I-4、RP-I-3中点样顺序为菌丝体(真菌一号、PDA、GPY)、RP-I-2菌液(真菌一号、PDA、GPY)、黄豆；RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4中点样顺序为菌丝体(PDA)、菌液(PDA)]。

图27种菌株次生代谢产物的正丁醇相TLC指纹图谱
Figure2TLC fingerprints ofN-butanol phase of secondary metabolites of 7 strains

3.3.2 重楼微生物次生代谢产物GNPS分析 GNPS分子网络中相关的分子之间形成分子笼，这些化合物分子笼可能代表着同一类型化合物，而不同分子笼间的连接关系可能代表着2个类型化合物之间存在关联。通过分子笼特征，分子网络能够快速找到与之关联的相似物或者新化合物，为追踪和预测某类成分提供有利指导[9-12]。以重楼活性物质为参照，通过二级质谱构建的不同菌株的GNPS分子网络(见图3～图4)，及实验室已建立的重楼化学成分库进行对比，发现并确定重楼微生物次生代谢产物与宿主有15个成分相同(见表5)，结构类型涉及螺甾烷醇类、偏诺皂苷元类、苯丙素类、黄酮类、蒽醌类及甾体皂苷等化合物。其中，来源于重楼根际土壤的微生物次生代谢产物中所含此类成分最多，来源于重楼叶的内生菌中可能含有苷类、苯丙素类及黄酮类化合物，来源于重楼茎的内生菌中可能含有偏诺皂苷元，此结论与TLC分析可能含有皂苷类、甾体类、苯丙素类和蒽醌类化合物一致，推测重楼菌株发酵液中有与重楼主要化学成分相同的化学成分。同时，在对目标菌株的GNPS分子网络分析中，RP-I-2菌及RP-I-4菌存在与宿主重楼相同的活性成分flazin(分子式为C17H12N2O4)，这与前面的TLC以及LC-MS的分析结果一致，该菌值得后续重点研究。

CLZG-hunbiaoRP-L-1-GPY-B-n-BuOHRP-L-1-GPY-S-n-BuOHRP-L-1-GPDA-B-n-BuOHRP-L-1-PDA-S-n-BuOHRP-L-2-PDA-B-n-BuOHRP-L-2-PDA-S-n-BuOHRP-L-3-PDA-B-n-BuOHRP-L-3-PDA-S-n-BuOHRP-L-4-PDA-B-n-BuOHRP-L-4-PDA-S-n-BuOHCLZG-hunbiaoRP-1-2-been-n-BuOHRP-1-2-GPY-B-n-BuOHRP-1-2-GPY-S-n-BuOHRP-1-2-PDA-B-n-BuOHRP-1-2-PDA-S-n-BuOHRP-1-2-zhenl-B-n-BuOHRP-1-2-zhenl-B-n-BuOHRP-1-3-been-n-BuOHRP-1-3-GPY-S-n-BuOHRP-1-3-PDA-S-n-BuOHRP-1-3-zhenl-S-n-BuOHRP-1-4-been-n-BuOHRP-1-4-GPY-S-n-BuOHRP-1-4-PDA-B-n-BuOHRP-1-4-PDA-S-n-BuOHRP-1-4-zhenl-S-n-BuOH

图37种菌株的GNPS网络图(Node中不同颜色代表不同培养基，节点之间连线代表2个化合物MS/MS图谱之间的相关性)

Figure3GNPS network diagrams of 7 strains (different colors in Node represent different media,and connections between nodes represent the correlation between MS/MS profiles of two compounds)

1a1b3a3b2457a7b68a8b9b109a111213b1413a15

图4重楼微生物次生代谢产物与宿主化学成分匹配分子笼放大图

Figure4Molecular cage enlargement of the matching of microbial secondary metabolites and host chemical components inParispolyphylla

表5 GNPS分析重楼次生代谢产物与宿主匹配的化学成分信息Table 5 Chemical composition information for GNPS analysis of secondary metabolites matching host Paris polyphylla

4 讨论

从药用植物内生菌次生代谢产物中寻找与宿主相同或相近的化学物质，以解决药用植物资源稀缺的问题，是近年来的研究热点。濒危药材重楼的主要药用成分是甾体皂苷[3-4]。赵江林等[20]从华重楼(《中国药典》收载的2种重楼基源植物之一)中分离得到2株细菌，并在TLC检测中发现其发酵液与重楼总皂苷的层析带迁移率相当，但由于TLC方法的局限性，在没有其他分析手段的辅助下不能严格证实皂苷类成分的存在。本文从药材重楼不同部位中共分离出20株内生菌，从其根际土壤中分离出12株根际相关的微生物，对其中的7株在不同培养条件下产生的次生代谢产物进行了TLC、LC-MS分析，并根据GNPS网络分子笼的特点，通过与已知宿主重楼的化学成分进行LC-MS分析，得出15个与宿主相同或相似的化学成分，结构类型涉及螺甾烷醇类、偏诺皂苷元类、苯丙素类、黄酮类、蒽醌类及甾体皂苷等化学物质。其中，来源于重楼根际土壤的微生物次生代谢产物中所含此类成分最多，可能含有甾体及其苷类、生物碱类、蒽醌类、脂肪酸酯、苯丙素类、黄酮苷类化合物及寡糖，来源于重楼叶的内生菌中可能含有甾体及其苷类、苯丙素类及黄酮苷类化合物，来源于重楼茎的内生菌中可能含有偏诺皂苷元，这对进一步研究和开发重楼内生及根际相关的微生物次生代谢产物具有重要意义，同时也为重楼的资源保护提供参考依据。