复方川贝止咳糖浆质量标准的研究

曾兰花，张坤，袁焕合，吴跃丽，黎嘉茗，周羽飞，黄俊忠

(1.广东省药品检验所，广东 广州 510663； 2.广东一力罗定制药有限公司，广东 云浮 527200)

复方川贝止咳糖浆是由川贝母、苦杏仁、枇杷叶、百部、化橘红、紫苏子、麻黄、百合、桑白皮、桔梗、甘草、薄荷脑等18味药材或提取物组成的复方制剂[1]。具有镇咳祛痰、润肺定喘的功能，用于伤风咳嗽、痰多、气喘。现行标准中仅有理化鉴别、相对密度检查等项目，不足以全面反映其整体质量。因此，本文参考相关文献，建立了化橘红、薄荷脑、枇杷叶、麦冬、川贝母、甘草的TLC鉴别方法和甘草酸、柚皮苷的质量分数测定方法[2-14]，为复方川贝止咳糖浆质量标准的建立提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-20A型紫外检测器(日本岛津公司)；SPD-M20A型二极管阵列检测器(日本岛津公司)；TLC Visualizer薄层数码成像系统(瑞士CAMAG公司)；KQ-A1000GDE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，频率40 kHz，功率1 000 W)；Silica gel 60薄层板(Merck公司，规格：10 cm×20 cm)。

1.2 试药

化橘红对照药材(批号：121165-201003)、柚皮苷对照品(批号：110722-201613，质量分数94.3%)、薄荷脑对照品(批号：110728-200506，质量分数99.9%)、熊果酸对照品(批号：110742-200313，质量分数99.9%)、枇杷叶对照药材(批号：121261-201303)、麦冬对照药材(批号：121013-201310)、西贝母碱对照品(批号：110767-201609，质量分数96.0%)、甘草对照药材(批号：120904-201519)、甘草苷对照品(批号：111610-201607，质量分数93.1%)、甘草酸铵对照品(批号：110731-201619，质量分数93.0%)、柚皮苷对照品(批号：110722-201312，质量分数94.3%)均购自中国食品药品检定研究院。

9批复方川贝止咳糖浆(批号：170101、170102、170103、170104、170105、170106、170107、170109、161104)及化橘红阴性样品、薄荷脑阴性样品、枇杷叶阴性样品、麦冬阴性样品、川贝母阴性样品、甘草阴性样品，均由广东一力罗定制药有限公司提供；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 化橘红的鉴别 取本品100 mL，加乙醚70 mL振摇提取，乙醚液备用，水层加乙酸乙酯100 mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取化橘红阴性样品100 mL，同法制成阴性对照溶液。另取化橘红对照药材1 g，加甲醇10 mL，于电炉上加热回流20 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。再取柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。按照薄层色谱法试验[3]，吸取上述4种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(体积比9∶3∶1)为展开剂，展开、取出、晾干，喷以3%(质量浓度)AlCl3乙醇溶液，晾干，在紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，见图1。

123456789101112

1～9.供试品(170101～170107、170109、161104); 10.化橘红阴性对照; 11.化橘红对照药材； 12.柚皮苷对照品。

图1化橘红鉴定薄层色谱图
Figure1Identification of Citri grandis exocarpium by TLC

2.1.2 薄荷脑的鉴别 取“2.1.1”项下的乙醚液，加活性炭2 g，搅拌，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。取薄荷脑阴性样品100 mL，同法制成阴性对照溶液。另取薄荷脑对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验[3]，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(体积比8∶3)为展开剂，将薄层板在展开缸中预平衡10 min，展开、取出、晾干，喷以1%(质量浓度)香草醛H2SO4溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图2。

1234567891011

1～9.供试品(170101～170107、170109、161104); 10.薄荷脑阴性对照； 11.薄荷脑对照品。

图2薄荷脑鉴定薄层色谱图
Figure2Identification of Menthol by TLC

2.1.3 枇杷叶的鉴别 取本品100 mL，加浓氨试液调节pH值至10，加乙醚100 mL振摇提取，分取乙醚提取液，蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取枇杷叶阴性样品100 mL，同法制成阴性对照溶液。另取枇杷叶对照药材0.5 g，加水微沸煎煮30 min，滤过，滤液浓缩至约20 mL，自“加浓氨试液调节pH值至10”起，同法制成对照药材溶液。再取熊果酸对照品适量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，分别吸取上述供试品溶液8 μL、阴性对照溶液8 μL、对照药材溶液和对照品溶液各2 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上。将薄层板点样的一端浸入1%碘-二氯甲烷溶液中约12～15 mm，使溶液浸过迅速取出，立即覆以一玻璃板，30 min后取下玻璃板，热风吹2～3 min，挥去薄层板上残留的溶液，再以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(体积比4∶2∶0.1)为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%(体积分数)H2SO4乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图3。

123456789101112

1～9.(170101～170107、170109、161104); 10.枇杷叶阴性对照； 11.枇杷叶对照药材； 12.熊果酸对照品。

图3枇杷叶鉴定薄层色谱图
Figure3Identification of eriobotry folium by TLC

2.1.4 麦冬的鉴别 取本品20 mL，加HCl 2 mL，置水浴上加热30 min，放冷，用乙醚100 mL振摇提取，分取乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。取麦冬阴性样品20 mL，同法制成阴性对照溶液。另取麦冬对照药材2 g，加水50 mL煎煮30 min，滤过。滤液自“加盐酸2 mL”起，同法制成对照药材溶液。按照薄层色谱法试验，分别吸取上述供试品溶液2 μL、阴性对照溶液2 μL、对照药材溶液4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(体积比3∶1)为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%(体积分数)H2SO4乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图4。

1234567891011

1～9.供试品(170101～170107、170109、161104); 10.麦冬阴性对照； 11.麦冬对照药材。

图4麦冬鉴定薄层色谱图
Figure4Identification of ophiopogonis radix by TLC

2.1.5 川贝母的鉴别 取本品100 mL，加浓氨溶液调节pH值至12，摇匀，加三氯甲烷200 mL振摇提取，分取三氯甲烷液，蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取川贝母阴性样品100 mL，同法制成阴性对照溶液。另取西贝母碱对照品适量，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，分别吸取上述供试品溶液15 μL、阴性对照溶液15 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上。以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-浓氨试液(体积比9∶14∶1.5)的上层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以稀碘化铋钾试液，再置碘缸中熏至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图5。

1234567891011

1～9.供试品(170101～170107、170109、161104); 10.川贝母阴性对照； 11.西贝母碱对照品。

图5川贝母鉴定薄层色谱图
Figure5Identification of fritillariae cirrhosae bulbus by TLC

2.1.6 甘草的鉴别 取本品50 mL，加水饱和正丁醇100 mL振摇提取，分取正丁醇液，用水100 mL洗涤，弃去水层，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。取甘草阴性样品50 mL，同法制成阴性对照溶液。另取甘草对照药材1 g，加乙醚40 mL，水浴回流1 h，滤过，弃去乙醚液，药渣加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，自“加水饱和正丁醇100 mL振摇提取”起，同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(体积比15∶1∶1∶2)为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%(体积分数)H2SO4乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点清晰，在紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，见图6。

123456789101112

1～9.供试品(170101～170107、170109、161104); 10.甘草阴性对照； 11.甘草对照药材； 12.甘草苷对照品。

图6甘草鉴定薄层色谱图

Figure6TLC Charts for identification of glycyrrhizae Radix et rhizome

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 Aglient Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.1%(体积分数，下同)H3PO4溶液为流动相B，按表1梯度进行洗脱；流速为1 mL/min；甘草酸铵、柚皮苷的检测波长分别为250、283 nm；柱温为30 ℃；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱条件表Table 1 Gradient elution condition table

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 混合对照品储备液的制备 精密称取甘草酸铵对照品0.010 56 g，柚皮苷对照品0.043 41 g，置50 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为甘草酸铵、柚皮苷混合对照品储备液(每1 mL含甘草酸铵0.192 4 mg，含柚皮苷0.818 7 mg)。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取本品5 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备 分别取甘草、化橘红阴性样品各5 mL，同“2.2.2.2”项下方法制成甘草阴性、化橘红阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验 分别精密吸取混合对照品储备液、供试品溶液与阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，依法测定，结果见图7～8。结果表明甘草、化橘红阴性对照均无干扰，专属性良好。

12BAC375325275225175125750?1031001101020304050607080900t/minU/mV

1.柚皮苷； 2.甘草酸铵; A.混合对照品储备液； B.供试品溶液； C.化橘红阴性对照溶液。

图7化橘红专属性试验(283 nm)HPLC色谱图

Figure7HPLC of Citri grandis exocarpium specific test (283 nm)

BAC211001101020304050607080900t/min9080706050403020100?103U/mV

1.柚皮苷； 2.甘草酸铵; A.混合对照品储备液； B.供试品溶液； C.甘草阴性对照溶液。

图8甘草专属性试验(250 nm)HPLC色谱图

Figure8HPLC of glycyrrhizae Radix et rhizome specific test (250 nm)

2.2.4 线性关系的考察 精密量取“2.2.2.1”项下的混合对照品储备液适量，加甲醇制成每1 mL含甘草酸铵0.0196 4、0.096 22、0.192 43、0.384 87、0.481 08、0.589 25 mg，含柚皮苷0.081 87、0.409 36、0.818 71、1.637 43、2.046 78、2.456 14 mg的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。以进样量(ng)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得回归方程如下：Y(甘草酸铵)=9.459 221×102X+6.091 761 7×103(R=0.999 2)；Y(柚皮苷)=1.955 704 0×103X+5.057 006 09×104(R=0.999 2)。结果表明：甘草酸铵在19.64～589.25 ng、柚皮苷在81.87～2 456.14 ng范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.2.2”项下制备的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，连续进样6次进行测定，结果甘草酸铵峰面积的RSD为0.2%，柚皮苷峰面积的RSD为0.3%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 精密量取本品(批号：170101)5 mL，共6份，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果甘草酸平均质量分数的RSD为1.1%(n=6)；柚皮苷平均质量分数的RSD为0.9%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取本品适量(批号：170101)，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、8、16、36、48、72 h进样，按“2.2.1”项色谱条件测定，结果甘草酸铵峰面积的RSD为1.2%，柚皮苷峰面积的RSD为0.3%，结果表明供试品溶液在72 h内稳定。

2.2.8 加样回收试验 取同一批复方川贝止咳糖浆(批号为170101，柚皮苷质量分数为0.396 mg/mL，甘草酸为0.102 mg/mL)9份，每份精密量取2.5 mL，置20 mL量瓶中。再分别精密加入混合对照品储备液0.6 mL共3份、1.3 mL共3份、2.0 mL共3份，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。取续滤液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算甘草酸和柚皮苷的回收率。结果甘草酸的平均回收率为106.3%，RSD为1.1%(n=9)；柚皮苷的平均回收率为99.5%，RSD为0.9%(n=9)。结果见表2，表明方法准确度较好。

2.2.9 样品测定 分别取9批复方川贝止咳糖浆 5 mL，分别按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，每批平行测2份，结果见表3。

表2 复方川贝止咳糖浆加样回收率试验结果Table 2 Recoveries of Compound Chuanbei cough syrup (n=9)

表3 9批复方川贝止咳糖浆中甘草酸、柚皮苷质量浓度测定结果

Table3The contents of glycyrrhizic acid and naringin in Compound Chuanbei cough syrup (n=2)ρ/(mg·mL-1)

批号甘草酸柚皮苷1611040.10 0.41 1701010.10 0.40 1701020.10 0.42 1701030.09 0.41 1701040.09 0.41 1701050.10 0.42 1701060.10 0.41 1701070.11 0.43 1701090.09 0.41

3 讨论

3.1 薄层鉴定条件的确定

研究表明，枇杷叶中主要含三萜酸类化学成分熊果酸和齐墩果酸[15]，而熊果酸和齐墩果酸为物理、化学性质极为相近的同分异构体，常同时存在[6]。故在建立枇杷叶的薄层鉴别中，尽量建立同时检测熊果酸和齐墩果酸的方法。考察中发现：展开前薄层板不浸入1%碘-二氯甲烷溶液，薄层色谱中的熊果酸和齐墩果酸斑点Rf值几乎相同；而薄层板展开前浸入1%碘-二氯甲烷溶液，熊果酸和齐墩果酸斑点能得到很好的分离，若样品中同时存在熊果酸和齐墩果酸，使用该方法两者均可检出。

川贝母的薄层色谱鉴别中，曾设计了以贝母素乙与西贝母碱作为研究对象，比较以①石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯-浓氨试液(体积比9∶14∶1.5，下同)的上层溶液和以②石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(9∶14)(样品置用浓氨试液预饱和的展开缸内展开)的展开系统，结果以①为展开剂时，贝母素乙与西贝母碱的Rf值适中，且分离度较好；以②为展开剂时，贝母素乙与西贝母碱的Rf值几乎相同，难以分离。故本试验采用①作为展开系统。

3.2 检测波长的选择

分别取甘草酸铵、柚皮苷对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL各含甘草酸铵、柚皮苷0.1 mg的溶液，在波长190～400 nm间扫描，结果甘草酸铵在(250±2) nm处有最大吸收，柚皮苷在(283±2) nm处有最大吸收，故选用甘草酸铵、柚皮苷的检测波长分别为250、283 nm。

3.3 耐用性考察

使用本文检测方法，考察了不同仪器(日本岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪、日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪)、不同色谱柱[(Aglient Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、SHISEIDO MGⅡ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和InertSustain C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)]、不同柱温(20～40 ℃)下的检测结果，结果均能得到较好重现。