道地药材平江白术挥发油的GC-MS指纹图谱研究

李然，李静，童巧珍，徐长琼，唐奇，夏丽琼，黄妍君，李旭富，黎春辉

(1．岳阳市中医医院，湖南 岳阳 414000； 2．广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006； 3.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208； 4.汕头大学医学院，广东 汕头 515041； 5.北京同仁堂平江白术有限公司，湖南 岳阳 414000)

白术药材为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎，又名“冬术”“浙术”“于术”，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效，可用于治疗脾虚食少、腹胀腹泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安[1]，主产于湖南、浙江、安徽、湖北、江西、四川等地。产于湖南平江县者，称为“平江白术”，俗称“平术”，平江白术有400多年的种植历史，早在明朝嘉靖年间，《本草纲目》中即有云：“白术瘦而黄者是幕阜山所出”，幕阜山位于今湖南省岳阳市平江县。清代同治《平江县志》物产篇盛赞“平术最著名”，因平江白术品质较佳，在国内外药材市场享有盛誉。

目前，关于平江白术的研究多集中在栽培技术方面，如朱校奇等[2]制定了栽培技术规程，宋英等[3]阐述了连作障碍的原因及其消除途径，但未见平江白术质量评价相关报道。白术的化学成分主要有挥发油、内酯类、苷类、多糖类、氨基酸等成分，而白术挥发油为其抗癌[4]、修复胃黏膜[5]、抑菌[6]等多重药效的物质基础。本实验拟在用GC-MS法对平江白术挥发油成分鉴定分析的基础上，建立道地药材平江白术挥发油的GC-MS指纹图谱，为其质量评价提供科学依据。

1 仪器与试药

DFT-200型手提式高速万能粉粹机(温岭市林大机械有限公司)；BSA224S-CW型电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；挥发油提取器；98-I-B型电子调温电热套(天津泰斯特仪器有限公司)；7890B-5977A 气相色谱-质谱联用仪(安捷伦公司)。

15批平江白术样品分别于湖南省平江县龙门镇、长寿镇、加义镇、平江县城、北京同仁堂等进行收集，由湖南中医药大学药学院童巧珍教授鉴定为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎，具体来源情况见表1。苍术酮对照品(成都普菲德生物技术有限公司，批号180621，质量分数≥98.0%)；无水Na2SO4(广东光华科技股份有限公司，批号20171120，分析纯)；三氯甲烷(广州化学试剂厂，批号20160202-2，分析纯)。

表1 15批平江白术样品来源信息

Table1Samples source information of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

编号来源编号来源S1平江龙门镇新和村S9平江加义镇杨林街村S2平江龙门镇纯良村S10平江加义镇丽江村S3平江龙门镇源里村S11平江加义镇杨林街村S4平江龙门镇大渔村S12平江长寿镇白沿村S5平江龙门镇丰福村S13平江县城S6平江龙门镇福寿村S14平江县城S7S8平江龙门镇河仙村平江龙门镇渣平村S15北京同仁堂平江白术有限公司

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取苍术酮对照品适量，精密称定，置2 mL容量瓶中，加入三氯甲烷溶解，定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取15批平江白术药材，各100 g，敲碎，再用粉碎机打碎，过2号筛。置1 000 mL圆底烧瓶中，加水500 mL，浸泡3 h，参照2015年版《中国药典》“挥发油测定法”提取平江白术挥发油。连续提取5 h，得油状物，冷却放置2 h后，读数并收集挥发油，加适量无水Na2SO4脱水。取挥发油20 μL，至2 mL棕色量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 GC-MS条件

2.3.1 气相色谱条件 HP-5 MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛细管柱，程序升温：柱初始温度为100 ℃，以3 ℃/min升至130 ℃，保留10 min，再以6 ℃/min升至250 ℃。进样量为0.1 μL；分流比为50∶1；气化室温度为250 ℃；载气为高纯度He(99.999%)。

2.3.2 质谱条件 EI离子源；离子源温度为230 ℃；电离能量为70 eV；四极杆温度为150 ℃；EM电压2 165 V；接口温度为280 ℃；溶剂延迟3 min；扫描质量范围m/z40～550。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度考察 取S15供试品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取0.1 μL，按“2.3”项下GC-MS条件，连续进样6次，记录色谱图，运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”(简称“相似度评价系统”)计算相似度，结果均为1.000，其中共有峰的相对峰面积的RSD值均<2.00%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性考察 取S15供试品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样0.1 μL，所得图谱运用相似度评价系统计算相似度，结果均为1.000，其中共有峰的相对峰面积的RSD值均<2.00%，表明各样品成分在24 h内稳定。

2.4.3 重复性考察 取S15供试品，分别按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，并按“2.3”项下条件分析，所得图谱运用相似度评价系统计算相似度，结果均为1.000，其中共有峰相对峰面积的RSD均<2.00%(范围：0.00%～0.62%)，表明本方法重复性良好，符合指纹图谱要求。

2.5 指纹图谱的建立及共有峰的鉴定

按“2.3”项下GC-MS条件，对15批平江白术供试品挥发油进行分析，测得GC-MS总离子流图。将积分后图谱数据导入相似度评价系统进行处理分析，建立平江白术挥发油GC-MS指纹图谱共有模式，见图1。各批平江白术挥发油总离子流图叠加图见图2。

1.280.960.640.320?107丰度12182430364206t/min1.苍术酮。1.280.960.640.320?107丰度12182430364206AB11

图115批平江白术药材GC-MS指纹图谱共有模式(A)及对照品(B)图谱

Figure1The maps of GC-MS fingerprint common pattern of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang (A)and the reference(B)

在平江白术挥发油GC-MS指纹图谱中，共标定出17个共有指纹峰，其中16号峰(苍术酮)为对照，其他16个共有指纹峰的相对保留时间依次为0.434、0.443、0.452、0.462、0.471、0.491、0.513、0.544、0.598、0.659、0.686、0.709、0.730、0.750、0.910、1.690，各共有峰相对保留时间RSD均<0.20%(范围：0.00%～0.12%)；17个共有指纹峰的总面积占GC-MS检出的平江白术挥发油总峰面积的90%以上。

通过NIST14标准质谱数据库检索，并查阅相关文献[7]，分析平江白术挥发油指纹图谱中共有峰成分，分析结果见表2。

1.280.960.640.320?107丰度12182430364206t/minS15S1

S1～S15. 表1中S1-S15样品。

图215批平江白术供试品的GC-MS指纹图谱叠加图

Figure2The Overlay map of GC-MS fingerprint of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

2.6 相似度分析

将15批平江白术指纹图谱数据导入相似度评价系统，以共有模式图谱为对照，计算各批白术挥发油图谱与共有模式图谱的相似度，结果15批白术挥发油指纹图谱与共有模式对照指纹图谱的相似度分别为0.999、0.989、0.999、1.000、0.999、1.000、1.000、0.999、0.999、1.000、0.921、0.998、1.000、0.994、0.999。有93.33%的供试品相似度在0.980以上，其中相似度最低者为S11，可见平江白术化学成分相似度较高，但质量存在一定差异。

2.7 聚类分析

以17个共有峰峰面积为变量，运用SPSS22.0统计学软件对15批平江白术样品进行聚类分析，采用组间链接，以值向量的余弦作为样品相似度的测度，结果见图3。当分类距离为5时，可分为2类，供试品S8、S15、S5、S10、S13、S12、S1、S9、S6、S7、S3、S4、S2、S14为一类，S11为一类，聚类趋势与相似度结果基本一致，二者分析结果可相互验证。

2.8 主成分分析

运用SPSS22.0统计分析软件对17个共有峰的峰面积进主成分分析，得到相关特征值及其方差，见表3。根据特征值与方差累积贡献率，共提取了5个主成分，方差累积贡献率达89.323%，可代表平江白术药材指纹图谱共有峰的大部分信息。

表2 平江白术挥发油共有成分分析Table 2 Analysis of common components in the essential oil of Atractylodes macrocephala Koidz. produced in Pingjiang

S8S15S5S10S13S12S1S9S6S7S3S4S2S14S111015202505

图315批平江白术药材聚类分析树状图

Figure3Cluster analysis dendrogram of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

表3 平江白术中17个共有峰的主成分特征值及方差

Table3Principal component eigenvalues and variances of 17 common peaks ofAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

主成分特征值方差贡献率/%方差累积贡献率/%16.35037.35637.35623.52220.71758.07332.37713.98072.05341.6509.70381.75751.2867.56689.323

主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和作用方向。17个共有峰对5个主成分影响的得分图见图4。由图4可知，除共有峰7、11、13、16、17对主成分1呈负相关，其余均为正相关，其中共有峰1、2、4、5、6、8、9、10、12对主成分1的贡献最大；17个变量对主成分2多为正相关，共有峰3、7、8、11、13、14、16、17对主成分2贡献最大，其中共有峰5、7、11、17与主成分2呈负相关；共有峰10、12、14、15对主成分3贡献最大；共有峰7、11、13、17对主成分4贡献最大；共有峰3对主成分5贡献最大，且与主成分5呈负相关。

进一步将各特征向量中心化和标准化后，15批平江白术样品的主成分排序坐标图见图5。由图5可知，第1主成分得分最高的为S2，第2主成分得分最高的为S5，第3主成分得分最高的为S14，第4主成分得分最高的为S11，第5主成分得分最高的为S7。以第1、2、3主成分得分做三维散点图，见图6。可将15批平江白术分为3类，其中S1、S2、S5、S6、S8、S10、S12、S14聚为一类，S3、S4、S7、S9、S13、S15聚为一类，S11聚为一类，此结果与相似度分析、聚类分析基本一致。

图4平江白术中共有峰5个主成分得分图

Figure4The map of 5 principal component scores of common peaks inAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

图515批平江白术中5个主成分的排序坐标图

Figure5The sorting graph of five principal components of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

主成分2主成分11.00.50.0-0.5-1.0-1.0-0.50.00.51.01.00.50.0-0.5-1.0主成分3

图6主成分得分三维散点图

Figure6Principal component score three-dimensional scatter map

3 讨论

本实验运用2015年版《中国药典》中的挥发油提取方法，提取了15批平江白术的挥发油。通过对色谱图的出峰数量、各峰分离度与丰度为指标进行测试条件考察，最终确定目前所用测试条件。方法学考察表明，使用该方法确定的平江白术挥发油GC-MS指纹图谱准确可靠，为评价平江白术质量提供重要参考。

不同批次平江白术中均含苍术酮等17种成分，占药材挥发性成分的90%以上，具显著代表性，故以此17种成分建立平江白术挥发油指纹图谱。但以上17种成分的种类和相对质量分数是否为平江白术的特征，仍需与更大样本量的非平江产白术进一步分析比较。

本试验初步确立了平江白术挥发油GC-MS指纹图谱的分析方法，建立了平江白术指纹图谱。该方法简单、可操作性强，可初步用于平江白术药材的鉴定，为平江白术的质量标准研究及质量控制提供理论基础。