DAB2IP稳定细胞系的构建及其对结直肠癌HT29细胞侵袭迁移能力的影响

来森艳 胡发涌 吴 维 李国东 李小兰 曹小年

DAB2IP(又名ASK1-interacting protein-1，AIP1)是RasGTPase活化蛋白家族的重要成员之一，其能够与细胞凋亡信号调节激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)结合，调控TNFα诱导的细胞凋亡[1]。DAB2IP能够抑制H-Ras、R-Ras以及TC21的活性从而抑制表皮生长因子诱导的前列腺癌细胞的增殖[2]。此外，DAB2IP能够通过调控PI3K/Akt信号通路，抑制前列腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡[3-4]。进一步研究发现，抑制DAB2IP能够通过诱导前列腺癌细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，促进其侵袭和迁移[5]。研究表明，DAB2IP在雄激素依赖和非依赖的前列腺癌患者中均存在缺失，其在肿瘤中的缺失主要是其启动子受表观遗传学调控所致。越来越多的研究发现，DAB2IP在许多实体瘤的发生和发展中发挥着重要的作用[6]，但是，目前关于DAB2IP在结直肠癌细胞中的功能却少有研究，为此，本研究利用实验室前期保存的DAB2IP高表达质粒，筛选了DAB2IP高表达的稳定细胞系，探讨DAB2IP对结直肠癌细胞侵袭及迁移能力的影响，并初步探索其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

结直肠癌HT29细胞由华中科技大学同济医学院附属同济医院分子医学中心实验室保存[15]，培养于37℃含5%的CO2培养箱中，胎牛血清、RPMI-1640培养基以及0.25%胰蛋白酶均购自美国Hyclon公司；GAPDH、DAB2IP、E-cadherin和vimentin一抗均购自CST公司(稀释浓度为1∶1 000)；二抗均购自北京康为生物公司(稀释浓度为1∶5 000)；转染试剂Lipofectamine2000购自上海英骏公司；OPTI-MEN购自美国Gibico公司；Western blot制胶试剂盒购自武汉谷歌生物公司；PVDF膜购自美国Millipore公司，Transwell小室购自碧云天生物公司。

1.2 DAB2IP高表达稳定细胞系筛选

将携带DAB2IP编码序列的pCDNA3.1质粒和空的pCDNA3.1质粒(由本实验室前期保存)通过Lipofectamin2000转染HT29细胞24 h后，向细胞中加入适量的G418进行筛选(10 μg/mL)，并以没有转染的HT29细胞为参照，维持筛选2周后通过Western blot和Real-time PCR进行验证。

1.3 Transwell实验

将稳定高表达DAB2IP和阴性对照的HT29细胞种植于Transwell小室无血清上层(104/孔)，下层为含10%血清的培养基，12 h后，洗去上层细胞，并以结晶紫染色下层细胞，最后于显微镜下观察，并取高倍视野下染色细胞计数，进行统计学分析。

1.4 细胞划痕实验

将稳定高表达DAB2IP和对应的阴性对照的HT29细胞种植于6孔板中，待细胞生长至95%以上融合度时，更换无血清培养基，以2 μm无菌移液器枪头于细胞中行划痕，并测量其宽度，12 h后，再次于显微镜下测量其宽度，两次差值为细胞迁移距离，重复实验三次，并分析统计学差异。

1.5 Western blot实验

正常培养稳定高表达DAB2IP的HT29细胞和阴性对照细胞，待细胞状态良好时收集细胞，以NP40裂解细胞并提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度，并计算各组蛋白上样量(50 μg/孔)，经SDS高温变性后上样，10%的SDS-PAGE凝胶电泳至合适时间，转膜(PVDF膜，350 mA，恒流转膜90 min)，4℃恒温孵育相应一抗过夜，洗涤(3次，15 min/次)，孵育相应的二抗(37℃，2 h)，最后于电子化学显色仪显色。检测各组蛋白中E-cadherin和vimentin蛋白的表达，并以GAPDH为参照调整上样量。

1.6 Real-time PCR方法

培养细胞至对数生长期，收集细胞，通过Trizol裂解法提取细胞RNA，并测量RNA浓度，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，根据特异性引物行Real-time PCR扩增，DAB2IP上游：5′-CTTGACCATGAACGCG CAGT-3，下游：5′-ATACTCTCTTTCAGCTGGGTCAGG-3；GAPDH上游：5′-GGAATTGACGGAAGGGCACCACC-3′，下游：5′-GTGCAGCCCCGGACATCT AAGG-3′，PCR扩增条件如下：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火，68℃延伸，循环数为40。结果分析采用2-ΔΔct法计算，公式如下：DAB2IP基因相对表达量=2-^{(实验组DAB2IP基因CT值-GAPDH基因CT值)-(对照组DAB2IP基因CT值-对照组GAPDH基因CT值)}。

1.7 统计分析方法

2 结果

2.1 DAB2IP高表达的HT29稳定细胞系的构建及鉴定

HT29细胞转染DAB2IP高表达质粒及对应的空载体后，加入10 μg/mL的G418筛选细胞。待细胞生长良好时收集细胞，提取细胞mRNA和总蛋白，通过Real-time PCR和Western blot方法检测各组细胞中DAB2IP的表达。结果发现，高表达DAB2IP组的细胞与阴性对照相比，其DAB2IP的mRNA水平为对照组的(12.45±1.35)倍，差异具有统计学意义(P<0.001)，Western blot结果表明，DAB2IP蛋白水平亦明显升高，表明DAB2IP稳定细胞系筛选成功(图1)。

2.2 DAB2IP对HT29细胞侵袭及迁移能力的影响

通过Transwell实验，计数穿过小室的细胞数，结果发现高表达DAB2IP组12 h后迁移细胞数及侵袭细胞数分别为268.2±15.4个及182.6±12.4个，对应的阴性对照组迁移及侵袭细胞数分别为106.4±5.6个及63.8±4.2个，两组差异均具有统计学意义(P<0.001)。进一步，我们通过细胞划痕实验检测DAB2IP对HT29细胞迁移能力的影响，结果发现，对照组细胞12 h迁移距离为205.6±6.8 μm，而高表达DAB2IP组细胞12 h迁移距离为98.6±3.4 μm，差异具有统计学意义(P<0.001)。以上结果表明，高表达DAB2IP能够明显抑制HT29细胞的侵袭及迁移能力(图2)。

图1 DAB2IP高表达稳定细胞系的构建Figure 1 Construction of stable cell line with high expression of DAB2IP in HT29 cellsNote：A.The mRNA level of DAB2IP was determined in high expression of DAB2IP and control HT29 cells by Real-time PCR；B.The protein level of DAB2IP was detected in high expression of DAB2IP and control HT29 cells by Western blot.

2.3 DAB2IP对HT29细胞E-cadherin和vimentin蛋白表达的影响

将高表达DAB2IP和阴性对照细胞正常培养至一定密度，收集细胞并裂解细胞总蛋白，通过Western blot方法检测各组E-cadherin和vimentin蛋白的表达，以GAPDH作为内参定量。结果发现高表达DAB2IP能够明显促进E-cadherin蛋白的表达，抑制vimentin蛋白的表达，表明高表达DAB2IP能够抑制HT29细胞上皮间质转化过程(图3)。

图3 高表达DAB2IP抑制HT29细胞EMT过程Figure 3 Over-expression of DAB2IP blocked epithelial-mesenchymal transition in HT29 cellsNote：The expression of DAB2IP，E-cadherin and vimentin protein was determined in HT29 cells with over-expressing DAB2IP or their control cells by Western blot.

图2 高表达DAB2IP抑制HT29细胞侵袭及迁移能力Figure 2 Over-expression of DAB2IP inhibited the invasion and migration of HT29 cellsNote：A.HT29 cells and HT29-DAB2IP over-expression cells were cultured in trans-well chamber，cell migration(up left)and cell invasion(down left)ability were tested by trans-well assay after 12 hours，and the corresponding quantization table is on the right(n=3)；B.HT29 control cells and HT29-DAB2IP over-expression cells were cultured in 6-well plate，cell migration ability was measured by Wound healing assay(n=3).

3 讨论

结直肠癌是威胁人类健康的最常见恶性肿瘤之一，许多基因的异常表达参与了结直肠癌的发生与发展过程，如抑癌基因APC、TP53失活突变；癌基因PI3K、KRAS、BRAF等的异常活化[7-9]。本实验室前期研究发现DAB2IP在结直肠癌中呈低表达甚至缺失状态，其异常低表达状态提示患者预后差，且低表达DAB2IP能够通过介导NFκB-p65信号通路及EMT信号通路维持细胞“干性”[10]。因此，本研究在实验室前期工作的基础上，初步探讨过表达DAB2IP在结直肠癌细胞中的功能。

肿瘤细胞的分化程度是影响肿瘤进展及预后的重要因素。本实验室前期研究发现DAB2IP在结直肠癌患者组织中呈明显表达，且DAB2IP的缺失或低表达与患者肿瘤的分化程度密切相关[10]。肿瘤细胞的侵袭迁移能力是影响患者预后的另一重要因素。Xie等[4]研究发现DAB2IP能够通过调控GSK-3β信号通路调控前列腺癌细胞的侵袭迁移能力，但在结直肠癌细胞中，目前关于DAB2IP影响细胞侵袭迁移能力的报道甚少。多种途径参与了肿瘤细胞侵袭及迁移能力的调控，包括基质金属蛋白酶家族(Matrix metalloproteinase，MMPs)表达的异常EMT、肿瘤细胞分泌促血管生成因子、肿瘤癌巢微环境的改变等[11]。其中，EMT在促进肿瘤细胞侵袭迁移能力的过程中发挥着重要的作用，也是目前研究肿瘤细胞侵袭迁移能力的热点。

为了进一步研究DAB2IP对结直肠癌细胞侵袭迁移能力的影响，我们利用前期实验室保存的过表达DAB2IP的质粒，成功筛选出了DAB2IP稳定高表达的HT29细胞系，并通过Real-time PCR及Western blot方法进行验证，这为我们以后进一步研究DAB2IP在结直肠癌中的功能提供了良好的工具。在此基础上，我们初步探索了DAB2IP对HT29细胞侵袭转移能力的影响，结果显示，高表达DAB2IP能够明显抑制HT29细胞的侵袭及迁移能力；我们进一步发现，高表达DAB2IP能够明显抑制HT29细胞的EMT过程。这表明DAB2IP可能通过经典的EMT过程调控HT29细胞的侵袭及迁移能力。但DAB2IP调控HT29细胞EMT的具体机制尚不完全明了，这是我们今后将继续研究的方向之一；此外，过表达DAB2IP是否能够诱导结直肠癌细胞的分化，这也将是我们进一步研究的方向。

EMT在细胞的多种生物学功能方面发挥着重要的作用，其中最主要为维持细胞的“干性”及促进肿瘤细胞侵袭转移。其中E-cadherin和vimentin是反应细胞上皮和间质状态的最主要表面标志物。研究表明，包括NF-κB、TGF-β及GSK-3β在内的多种信号通路参与了细胞EMT过程，其主要通过调控EMT相关转录因子的表达调控细胞EMT进程，后者包括TWIST1、SNAIL1/2及Zeb1/2[12-14]。研究发现DAB2IP在不同肿瘤细胞中调控细胞EMT过程的机制不尽相同，在前列腺癌细胞中，DAB2IP可能通过调控GSK-3β介导的信号通路调控细胞的侵袭迁移能力[4]，但在结直肠癌细胞中，DAB2IP可能通过调控NF-κB介导的信号通路调控细胞EMT，从而在结直肠细胞的“干性”维持中发挥着重要的作用[10]，这表明DAB2IP调控细胞EMT进程的机制比较复杂，可能存在多种途径，进一步深入研究DAB2IP在细胞EMT进程中的机制对发掘DAB2IP的功能具有重大的意义，可能为治疗转移性结直肠癌患者提供新的靶点和思路，改善患者预后。

综上所述，在成功构建的DAB2IP稳定高表达的HT29细胞中，细胞的侵袭及迁移能力受到明显抑制，其可能通过抑制细胞EMT来实现，我们前期研究亦发现低表达DAB2IP能够通过促进细胞上皮间质转化过程，促进细胞的侵袭及迁移能力，提示针对DAB2IP及相关通路蛋白的研究，可能为结直肠癌的治疗提供新的理论依据。