多重RPA-LFD技术快速检测磺胺类耐药基因研究

马 骉，郑 超，黄丽芬，李安源，王家敏，毛崇辉，张明洲

(1.中国计量大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018；2.浙江省 生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江 杭州 310018)

近年来，随着畜禽养殖产业的迅速发展，畜禽感染细菌性疾病等问题日趋突出。抗生素过量使用甚至滥用带来的 “超级耐药菌”问题，已经引起了全世界的广泛关注[1-4]。磺胺类药物是一类人工合成抗菌药，对大多数革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用[5]。由此产生的磺胺类耐药微生物屡在畜禽体内、粪便及肉制品中被检出[6-7]。基于此，对磺胺类耐药基因的快速、精准检测，对于细菌耐药性的控制具有非常重要的意义。

传统生化方法由于检测时间长、人工判读检测结果等原因，已满足不了当下快速检测细菌耐药性的需求。随着分子生物学的发展，分子检测技术越来越多地应用到实际生活中。PCR、荧光定量PCR和LAMP等方法都成功应用于耐药基因的检测[8-11]。易污染、依赖精密仪器、低检测效率等问题，制约着现场检测的应用推广。重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)是一种在常温下可以快速扩增核酸的方法[12]。在25～42 ℃的等温条件下，重组酶与寡核苷酸引物结合，形成引物和酶的复合体。酶促反应使引物定位到DNA双链模板上的同源靶序列，并在单链DNA结合蛋白的协助下解链模板 DNA。随后在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链[13-20]。横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)是一种简易的检测装置，可用于靶核苷酸的定性或半定量检测[21-23]。当结果为阳性时，可在检测区内形成肉眼可见的红色条带，无需借助仪器就可在现场或条件受限地区推广[24]。RPA-LFD技术具有操作简单、灵敏度高、特异性强、适用于现场快速诊断等特点，在动物疾病早期诊断、进出口快速检疫、动物食品安全卫生等方面具有良好的应用前景，已成为有效监测和控制耐药菌扩散的强有力工具之一[25-26]。

本项目拟在前期研究工作基础上，采用多重RPA-LFD技术对磺胺耐药基因sul1，sul2和sul3进行同步检测，建立一种准确、有效的多重快速检测动物源大肠杆菌磺胺类耐药基因的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所使用的部分样本从养殖场宰杀的猪的粪便以及体表所提取，另外部分从农贸市场取得，共计18组285个样品(详见表1)。所有菌株保存于浙江海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室。LB Broth购自Sangon Biotech公司，Agar Powder 购自青岛高科园海博生物技术有限公司，基因组DNA提取试剂盒购自BioTeke公司，PCR相关试剂购自TaKaRa公司，RPA相关试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司。

1.2 DNA模板提取和标准质粒的构建

细菌基因组DNA提取。取3 mL动物源大肠杆菌培养液置于1.5 mL的离心管中。加入Buffer GTL和 Proteinase K涡旋震荡混匀，56 ℃孵育至溶液清亮。加入Buffer GL和无水乙醇，涡旋震荡混匀后短暂离心后加入吸附柱，12 000 r/min离心1 min，弃废液。加入500 μL Buffer GW1，12 000 r/min离心1 min。加入500 μL Buffer GW2，12 000 r/min离心1 min。吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。将吸附柱置于离心管中，向吸附柱中加入50 μL Buffer GE，室温放置3 min，12 000 r/min离心1 min，-20 ℃保存用于后续实验。

标准质粒的构建。提取实验室前期筛选得到并且含磺胺耐药基因sul1，sul2，sul3的大肠杆菌ZFB1-2/17的总DNA，通过PCR克隆分别获得sul1，sul2，sul3的基因片段并进行纯化(图1)。使用TaKaRa公司 In fusion 产品，将目的片段与pET23a载体连接后，转化到大肠杆菌BL21中培养。筛选单菌落后进行测序验证，并使用MegAlign软件比对校验。

M—DL2000 DNA Marker; P—阳性质粒扩增条带; S—阳性样本扩增条带; N—阴性对照; 1—sul1, 2—sul2, 3—sul3。图1 目的基因片段PCR克隆电泳图Figure 1 Electrophoretogram of target gene fragment by PCR

1.3 RPA引物设计

根据NCBI数据库中提供的sul1，sul2，sul3基因序列，使用primer primier5.0软件，设计RPA引物，并交由Invitrogen公司合成。引物序列如下：

sul-1-F1：AAGACGCTCGACGAGATTGTGCGGTTCTT

sul-1-R1：AATAGCGGAAGCCCCAACGCCGACTTCAGCT

sul-2-F1：CATCGTCAACATAACCTCGGACAGTTTCTCG

sul-2-R1：GGTTGATAACTGTCGAGCGAGACGGGAATG

sul-3-F1：GCCGCTTCCAGTAATCCTGATACAACTGAA

sul-3-R1：TTTCTGGATTAGAGCCTAAAAAGAAGCCCATAC

1.4 反应体系的优化

在单重RPA反应体系的基础上，探索并优化多重RPA反应体系中各组分浓度及反应参数，如醋酸镁浓度、反应温度和反应时间等。确定最优反应条件后，进行灵敏度和特异性的测试。

分别对sul1，sul2，sul3的引物进行荧光标记(5’端分别标记Biotin，Digoxin，FITC基团)，RPA扩增后产生不同荧光标记的产物。在层析作用下，与标记在试纸条上的对应抗体结合，发生抗原抗体免疫反应。通过单抗体的添加量、喷金量，样品垫、NC膜和金垫等参数优化，达到更好的肉眼识别效果。

1.5 多重RPA-LFD的特异性和灵敏度

以ZFB1-7/12(sul1)、ZFB1-5/14(sul2)、ZFB1-4/6(sul3)、ZFB1-9/7(sul1+sul2)、ZFB1-2/8(sul1+sul3)、ZFB1-8/9(sul2+sul3)、ZFB1-2/17(sul1+sul2+sul3)7种含有不同磺胺耐药基因型的动物源大肠杆菌模板DNA为阳性对照，以不含磺胺耐药基因的动物源大肠杆菌为阴性对照，分析多重RPA-LFD检测方法的特异性。

将重组质粒进行10倍梯度稀释，分别进行三种磺胺类耐药基因的灵敏度实验。在此基础上，进行多重灵敏度实验。选取同时含有三种耐药基因的大肠杆菌ZFB1-2/17作为多重RPA-LFD灵敏度实验的模板。同时使用qPCR方法验证其结果的准确性。

1.6 多重RPA-LFD技术的评价

使用来自农贸市场及养殖场采集的动物源大肠杆菌样品，用于磺胺类耐药基因多重RPA-LFD检测方法的评价研究。提取样品DNA后，采用优化后的RPA-LFD体系进行检测，并与qPCR的检出结果进行数据比对分析，计算实际样本中的耐药基因检出率。

2 结果与分析

2.1 多重RPA-LFD扩增体系优化

多重RPA反应体系(20 μL)如下：12.5 μL的2x Reaction Buffer、4.5 μL的dNTPs、0.8 μL SDW、2.5 μL的10x Basic E-mix、10 μM的Primer F、10 μM的Primer R、1.25 μL的20x Core Reaction Mix、1.25 μL的280 mM MgOAc、1 μL模板DNA。通过优化，反应的最优温度为40 ℃，反应开始20 min后即可终止(图2)。另外，优化后的LFD显色体系中，生物素单抗包被浓度为0.5 mg/mL，地高辛单抗标记浓度为10 μg，喷金量为0.3 μL/cm、显色时间控制在10 min。

a—反应时间;b—反应温度;c—Mg2+浓度。图2 多重RPA-LFD扩增体系优化Figure 2 Optimization of multiple RPA-LFD

2.2 多重RPA-LFD的灵敏度和特异性

在多重RPA扩增体系中，分别加入含有sul1、sul2、sul3、sul1+sul2、sul1+sul3、sul2+sul3、sul1+sul2+sul3的不同磺胺耐药基因型的动物源大肠杆菌模板DNA，对照组扩增模板为不含磺胺耐药基因的大肠杆菌目标DNA，空白组扩增模板为无菌水。扩增反应后，用试纸条进行检测(图3)，结果显示特异性良好。

在多重RPA扩增体系中，加入分别含有sul1、sul2、sul3、sul1+sul2、sul1+sul3、sul2+sul3、sul1+sul2+sul3的不同磺胺耐药基因型的动物源大肠杆菌模板DNA，模板进行梯度稀释，空白组加1μL无菌水。实验结果显示，多重RPA的灵敏度可以到达103copies/μL(图4)。

图3 多重RPA-LFD特异性检验Figure 3 Specificity of multiple RPA-LFD

图4 多重RPA-LFD灵敏度检验Figure 4 Sensitivity of multiple RPA-LFD

2.3 实际样本检测结果的比对分析

对实验所使用的285株动物源大肠杆菌分离株进行RPA-LFD检测，实验结果统计详见表1。实验结果显示，动物源大肠杆菌中磺胺类耐药基因检出率达到81.05%(231/285)，其中含1种sul基因的菌株为41.40%(118/285)，含2种sul基因的菌株为31.23%(89/285)，含3种sul基因的菌株为8.42%(24/285)。这一结果与qPCR法检测分析的结果一致。

3 结 论

常规PCR、荧光定量PCR、LAMP等温扩增等方法已被广泛应用于细菌耐药性检测，具有较高的特异性和灵敏度。但常规PCR方法需要进行电泳检测，操作繁琐且容易引起污染；荧光定量PCR方法对仪器要求较高；LAMP方法在等温条件下扩增，摆脱了对仪器的依赖，但存在假阳性现象且极易污染[27]。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)可以在较低的恒温条件下，快速扩增目的片段，在不依赖仪器设备的基础上，可以克服样本杂质对扩增效率的影响。同时，RPA对引物设计的要求较高，目前没有相关设计软件，只能靠人工判读引物参数，进而进行引物筛选预实验。本研究经过多次优化实验，建立了反应时间短、操作简单的多重RPA扩增体系，仅需在40 ℃环境下孵育20 min即可使用试纸条显色，显色10 min即可肉眼观察结果。同时利用qPCR方法做对比，灵敏度可以到达103CFU/mL，在保证特异性的同时，相较其他方法得到更稳定、更精确的检测结果。为有效避免污染，在实验过程中，必须严格遵循独立工作区域单一方向操作原则，利用超净工作台进行试剂配置与分装，严格进行消毒杀菌环节，防止交叉污染和操作不当造成的污染，尽量避免假阳性结果。

通过本研究建立的磺胺类耐药基因sul1，sul2和sul3的多重 RPA-LFD检测技术，为动物源大肠杆菌及其耐药性检测提供了技术支持，对预防和切断猪肉生产、加工、销售中耐药性细菌传播有重要意义。同时，本文使用的方法，可为食品中其他致病微生物及其耐药性基因的快速检测研究提供了借鉴方法，使得食品中致病微生物及其耐药性检测向高通量、高灵敏、简便经济的方向发展。