当归调经颗粒(无糖型)的质量标准研究

唐靖雯 卢礼平 李娇娇 杨 桃 潘 梅

贵州威门药业股份有限公司，贵州 贵阳 550018

当归调经颗粒由当归、熟地黄、川芎、党参、白芍、甘草、黄芪等7味药材组成，收载入《中国药典》2015年版。具有补血助气、调经的功效，用于贫血衰弱、病后、产后血虚以及月经不调、痛经。本研究在当归调经颗粒含糖型基础上，完成了其无糖型产品的质量标准研究并建立了企业内控质量标准，为广大患者提供了一个治疗痛经的产品。为保证临床用药的安全、有效以及更好地控制产品质量，本研究采用薄层色谱法对制剂中当归、川芎、甘草、黄芪、白芍等5味药材进行定性鉴别；建立了以制剂中白芍的主要活性成分芍药苷为指标性成分的HPLC含量测定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器、ChemStation色谱工作站、1200型自动进样器(美国Agilent公司)；AG135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；CH-250型超声波清洗机(天津恒奥科技公司，功率：250W，频率：40KHz)；硅胶G(青岛海洋化工厂分厂，批号：20150701)。

1.2 药品与试剂 无糖型当归调经颗粒(批号：170501、170502、170503，贵州威门药业股份有限公司)；芍药苷对照品(批号：110736-201741，中国食品药品检定研究院)；磷酸(批号：10015408，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈为色谱纯；乙酸乙酯、三氯甲烷、冰醋酸、环己烷、无水乙醇均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 当归、川芎的鉴别 取本品10 g，研细，加水30 mL使溶解，用乙醚振摇提取2次(水液备用)，每次使用20 mL，将两次乙醚提取液合并，挥干乙醚提取液，残渣加l mL甲醇使完全溶解，作为供试品溶液。分别取当归、川芎药材，按照供试品溶液的制备方法分别制成当归、川芎对照药材溶液。另按制剂的处方比例称取适量缺当归、川芎药材的其他各味药材，按该制剂的制备工艺制成颗粒，取颗粒适量，按上述制备供试品溶液的操作方法制成缺当归、川芎药材的阴性样品。照薄层色谱法(2015年版中国药典四部，通则0502)，分别依次吸取上述当归对照药材、川芎对照药材、阴性样品、供试品溶液各4 μL，分别依次点于同一硅胶G薄层板，选用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)的溶液为展开剂进行展开，取出硅胶板后放置晾干，将晾干的硅胶G薄层板置紫外光灯(365 nm)下检视。结果，当归的TLC图中，不同批次供试品溶液所呈现的斑点完全一致，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。如图1所示。

2.1.2 甘草的鉴别 取本品10 g，研细，加乙醚40 mL，超声处理30 min，滤过，弃去乙醚液，残渣挥干乙醚，加水40 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20 mL，分取正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇l mL使溶解，作为供试品溶液。另取甘草药材及缺甘草的阴性样品适量，按上述供试品溶液的制备方法分别制成甘草对照药材溶液、缺甘草的阴性样品溶液。照薄层色谱法(2015年版中国药典四部，通则0502)，分别吸取上述甘草对照药材、阴性样品、供试品溶液各6 μL，分别依次点于同一硅胶G薄层板，选用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)的溶液为展开剂进行展开，取出硅胶板后放置晾干，将晾干的硅胶G薄层板置紫外光灯(365 nm)下检视。结果，当归的TLC图中，不同批次供试品溶液所呈现的斑点完全一致，且阴性无干扰。如图2所示。

2.1.3 黄芪的鉴别 取“2.1.1”项下的备用水溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次20 mL，分取正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇l mL使溶解，作为供试品溶液。取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每l mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。另取缺黄芪的阴性样品适量，按上述供试品溶液的制备方法制成缺黄芪的阴性样品溶液。照薄层色谱法(2015年版中国药典四部，通则0502)，分别吸取上述黄芪苷对照品、阴性样品、供试品溶液各6 μL，分别依次点于同一硅胶G薄层板，选用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液作为展开剂，取出硅胶板后放置晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光及紫外光(365 nm)下检视。结果，黄芪的TLC图中，不同批次供试品溶液所呈现的斑点完全一致，日光下显相同颜色的斑点，紫外光下显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。如图3、图4所示。

2.1.4 白芍的鉴别 取本品10 g，加乙醇10 mL，振摇5 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇l mL使溶解，作为供试品溶液。取芍药苷对照品，加乙醇制成每l mL含l mg 的溶液，作为对照品溶液。另取缺白芍的阴性样品适量，按上述供试品溶液的制备方法制成缺白芍的阴性样品溶液。照薄层色谱法(2015年版中国药典四部，通则0502)，分别吸取上述芍药苷对照品、阴性样品、供试品各10 μL，分别依次点于同一硅胶薄层板，选用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂进行展开，取出硅胶板后放置晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果，白芍的TLC图中，不同批次供试品溶液所呈现的斑点完全一致，与芍药苷对照品相应的位置上，显相同的斑点，且阴性无干扰。如图5所示。

2.2 芍药苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-0.1%磷酸溶液(12∶88，V/V)；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 供试品溶液[2]取装量差异项下的本品，研细，从中取约2.5 g药物粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL使溶解，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.2 对照品溶液 取芍药苷对照品适量，精密称定，用甲醇配制成每1 mL含35 μg的溶液，既得。

2.2.2.3 缺白芍的阴性样品 按处方称取缺白芍的群药，按上述供试品溶液的制备方法制成缺白芍的阴性样品溶液。

2.2.3 系统适用性试验[3-5]精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液、供试品溶液、缺白芍的阴性样品溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。理论板数按芍药苷峰计算>3000，分离度>1.5。色谱如图6所示。

2.2.4 线性关系 取芍药苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成0.2192 mg/mL的溶液，分别精密量取0.5、1、2、4、8、16 μL至25 mL的容量瓶中，加甲醇稀释刻度。按“2.2.1”项下色谱条件，各进样10 μL，记录峰面积，以各对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。回归方程：A= 14.254C-25.694，r=0.9998。结果表明，对照品溶液浓度在(4.38～140.16)μg/mL范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取样品(批号170501)，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录芍药苷的峰面积。结果，峰面积RSD为0.28%，表明仪器精密度较好。

2.2.6 稳定性试验 取样品(批号170501)，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定记录色谱峰。结果，峰面积的RSD为1.72%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批样品(批号170501)6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，以外标一点法计算芍药苷的含量。结果，含量的RSD为1.96%，表明本方法的重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知芍药苷含量的当归调经颗粒(无糖型，批号：170501，含量为0.3427 mg/g)，采用加样回收法，测定本方法的回收率。精密称取本批次当归调经颗粒1.25 g，分别精密吸取芍药苷对照品溶液(35.20 μg/mL)10 mL，按“2.2.2”项下的方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，计算白芍苷的加样回收率，结果详见表1。

2.2.9 样品含量的测定 取3批样品(批号170501、170502、170503)各适量，按 “2.2.2”项下方法制成供试品溶液，精密吸取10 μL注入HPLC仪，按“2.2.1”项下色谱条件记录色谱图；另取“2.2.2”项下对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品的含量，结果详见表2。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)

表2 样品含量测定结果 (n=3)

3 讨论

研究对制剂中当归、川芎进行TLC 定性鉴别时，按照文献方法：分别用正己烷-乙酸乙酯(9∶1)、正己烷-乙酸乙酯(4∶1)作为展开剂进行TLC定性鉴别，结果供试品色谱中均未显示斑点。在多次尝试的基础下发现，以两种溶剂作为展开剂时始终无法获得理想的展开效果，故最终选择采用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)的4种溶剂作为展开剂，所得的供试品色谱中斑点也较为清晰。

制剂中当归、白芍的主要活性成分分别为阿魏酸、芍药苷，在含量测定的指标性成分如何选取过程中，考虑到君药当归中阿魏酸含量较低，故选择含量较高、成分较稳定的活性成分芍药苷作为指标性成分，采用高效液相色谱法测定白芍中芍药苷的含量。但由于中药制剂成分复杂且该制剂中白芍所占比例小等因素，仅以白芍中芍药苷作为指标性成分来控制该制剂质量明显不足，因此在后续的研究中，应优化臣药中阿魏酸的提取方法，增加制剂中阿魏酸提取量，建立多指标性成分的含量测定方法，以更有效地控制该制剂的质量。

综上，本研究建立的质量控制分析方法，经过对多批产品的验证，结果表明该质量控制方法简便、准确，可用于当归调经颗粒(无糖型)生产过程质量控制，能有效地保证产品临床用药的安全性、有效性和可控性。