不同产地干姜中氨基酸成分对比研究

张美慧 李瑞海

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

姜系姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根茎，是一种广泛应用的药食两用植物。干姜是姜的干燥品，味辛性热，归脾、胃、肾、心、肺经，温中散寒，回阳通脉，燥湿消痰，主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、肢冷脉微、痰饮喘咳[1]。

目前，对干姜中其他类有效成分研究较为广泛，对氨基酸类成分研究较少。氨基酸为人体必需的营养物质，对于它的研究尤为必要。氨基酸是构成蛋白质分子的基本单位，也是构成人体内最基本物质之一。氨基酸在人体内通过代谢可以发挥一些作用，比如合成组织蛋白质转变为碳水化合物和脂肪变成酸、激素、抗体、肌酸等含氨物质氧化成二氧化碳、水和尿素，产生能量。氨基酸在人体中的存在，不仅为合成蛋白质提供了重要原料，而且为促进生长，进行正常代谢、维持生命提供了物质基础[2]。

本实验采用柱前衍生化高效液相色谱法检测干姜中不同氨基酸的含量，并对不同产地的干姜药材中18种氨基酸进行含量测定，以期为干姜药材的质量评价及氨基酸含量研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 P230II大连依利特氨基酸自动分析仪；UV230II紫外检测器(大连依利特公司)；ALC-110.4电子分析天平(北京赛多利斯特仪器系统有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；SF-130B高速粉碎仪器机(上海冠联制药装备有限公司)；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药与材料 18种氨基酸对照品(批号：20100108，中国药品生物制品检定所)；2,4-二硝基氟苯(大连依利特公司)。乙腈为色谱纯；冰醋酸、N,N-二甲基酰胺为分析纯；水为纯净水。干姜经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定符合药典要求。

2 方法与结果

2.1 流动相的配制 A相：乙腈-水(1∶1)；B相：固体组分B[l1]4.1g加水950 mL，冰醋酸调pH至6.4～6.8，加10 mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1000 mL量瓶中，摇匀后过滤，备用。

2.2 色谱条件[3]色谱柱：ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm，大连依利特)；柱温：27 ℃；检测波长360 nm；流速1.2 mL/min，梯度洗脱，流动相梯度洗脱曲线见表1。

表1 流动相梯度洗脱曲线

2.3 衍生缓冲溶液的配制 取衍生缓冲溶液固体组分A[l2]1.24 g；固体组分B[l3]7.63 g，加水定容至500 mL量瓶中，摇匀，备用。

2.4 平衡缓冲溶液的配制 取平衡缓冲溶液固体组分A[l4]0.91；固体组分B[l5]3.58 g，加水定容至250 mL量瓶中，摇匀，备用。

2.5 对照品溶液的制备 氨基酸对照品适量(丙氨酸5.1 mg、组氨酸5.0 mg、脯氨酸4.9 mg、精氨酸5.3 mg、亮氨酸5.6 mg、丝氨酸4.8 mg、天门冬氨酸5.3 mg、异亮氨酸4.8 mg、苏氨酸5.0 mg、半胱氨酸5.0 mg、赖氨酸5.0 mg、色氨酸5.1 mg、谷氨酸5.0 mg、蛋氨酸4.9 mg、缬氨酸4.9 mg、甘氨酸4.9 mg、苯丙氨酸5.6 mg、酪氨酸2.7 mg)，精密称取，加衍生缓冲溶液定容至25 mL容量瓶中，精密吸取1 mL，加衍生缓冲溶液定容至10 mL容量瓶中，备用。

2.6 供试品溶液的制备 取样品粉末0.2 g，精密称定，置具塞试管中，加3 mL 6 mol/L盐酸溶液[4]，混匀，置烘箱110 ℃中水解24 h。水解后样品多次用水洗涤从具塞试管转入蒸发皿中，80 ℃水浴加热蒸干。衍生缓冲溶液多次洗涤蒸发皿，转入25 mL容量瓶中，用衍生缓冲溶液定容，混匀，0.45 μm微孔滤膜过滤。取已过滤的样品液2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加入衍生化试剂1 mL，放入60 ℃水浴中暗处反应1 h，取出冷却至室温，加平衡缓冲溶液定容至刻度，静置15 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.7 标准曲线的绘制 取2.5项下25 mL容量瓶中对照品溶液0.01、0.50、1.00，1.50、2.00 mL分别置于10 mL棕色容量瓶中，分别加入衍生化试剂0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按“2.6”方法制备。进样量为20 μL按照“2.2”项下色谱条件，进样测定，以各个氨基酸对照品溶液的进样量为横坐标X(μg)，相对应的峰面积值为纵坐标Y，绘制标准曲线，各个氨基酸的回归方程及线性范围见表2。

表2 各氨基酸成分的回归方程及线性范围

续表2

表2 各氨基酸成分的回归方程及线性范围

2.8 方法学考察

2.8.1 精密度试验 取对照品溶液，按“2.2”色谱条件，连续进样6次测定，各峰面积的RSD均≤2.00%，表明精密度良好。

2.8.2 重现性试验 取样品6份适量(过40目筛，每份约200 mg)，精密称定，按“2.6”方法制备供试品溶液，按“2.2”色谱条件进样测定，计算样品中各氨基酸的含量，结果RSD≤2.0%，表明此方法具有良好的重现性。

2.8.3 稳定性试验 取四川供试品溶液，按“2.2”色谱条件，于2、4、8、10、12、24 h进样测定，各色谱峰的相对峰面积的RSD均≤2.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8.4 加样回收率试验 分别取已知含量的四川样品6份粉末适量(过40目筛，每份约100 mg)，精密称定并分别加入对照品溶液适量(从天冬氨酸至酪氨酸分别加入对照品1.1845、1.8030、0.9485、1.3275、0.5860、4.3495、0.6835、1.0175、1.7905、2.1670、2.1805、0.9495、1.0640、0.2230、0.9290、2.3285、0.9680、0.2080 mg)，按照“2.6”方法制备供试品溶液，按照“2.2”色谱条件，进样测定，计算加样回收率的RSD均≤2.00%。

2.9 干姜样品含量测定 分别精密吸取各供试品溶液5 μL，按“2.2”的色谱条件，进样测定，依据标准曲线回归方程，计算各氨基酸的含量见表3。对照品及样品色谱图如图1，图2所示。

表3 干姜18种氨基酸的含量

续表3

表3 干姜18种氨基酸的含量

3 讨论

研究可知，干姜中含有所检测的18种氨基酸，并包括人体必需的8种氨基酸即组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸及缬氨酸。可见，干姜中所含的氨基酸种类十分丰富。

产地为四川、贵州省的干姜中所含人体必需氨基酸总量相对较高，分别达到113.85 mg/g、104.47 mg/g。广东省、山东省、云南省人体必需氨基酸总量较低，分别为82.77 mg/g、 63.58 mg/g、13.86 mg/g。其中，产地为云南的干姜所含人体必需氨基酸总量最低。产地为四川、贵州省的干姜中所含氨基酸总量相对较高，分别达到247.39 mg/g、250.21 mg/g。广东省、山东省、云南省氨基酸总量较低，分别为208.85 mg/g、 200.97 mg/g、76.83 mg/g。其中，产地为云南的干姜所含氨基酸总量最低。

不同产地干姜中含有的不同氨基酸含量有较大差异。相比于其他四省，四川干姜中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的含量最高。贵州干姜中精氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、络氨酸含量最高。广东省、山东省、云南省干姜中各氨基酸含量稍低，五省干姜中不同氨基酸含量差异明显。鉴于本次实验样品数量较少，拟增加样本数，再进行实验研究。本实验所建立的干姜的18种氨基酸含量测定方法，方法简单、易行，适用于干姜的氨基酸成分的质量控制。