培养料锌含量对灵芝子实体品质的影响*

唐 振，周 洁，谭 伟**，李小林，张 波，叶 雷，张小平

（1.四川省农业科学院 土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.四川农业大学资源学院，四川 雅安 625014）

锌是人体正常发育必需的微量元素，参与机体内多种重要生理代谢，缺锌或锌浓度较低会导致心血管病、肝硬化、糖尿病、视力减弱、记忆力下降、肿瘤等多种疾病发生[1]。FAO/WHO推荐每人每日锌摄入量为15 mg ～ 60 mg，日常食物中锌的含量大多较低，仅靠食物中的锌无法满足人体正常需求，全球约有1/3左右的人口处于缺锌状况[2]；而直接用无机锌作为锌的补充来源容易导致锌摄入过量，引起锌中毒及贫血等症状[3]。因此，可采取生物强化（在生物生长及其代谢过程中进行营养元素的富集以提高其营养价值）途径，将外源添加的无机锌转化为生物锌，获得富锌食品，通过饮食来增加人体所需锌元素摄入量，该方法具有安全可靠、易于吸收和稳定性强的优点[2-3]。

灵芝（Ganoderma lucidum）是我国传统的名贵中药材，具有“补气安神、止咳平喘”的功能，主治“心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘， 虚劳短气， 不思饮食”的病症[4]。 本研究中，采取在固体培养基质中添加醋酸锌（ZnAC）栽培灵芝子实体的方法，探讨不同锌含量的培养基质对灵芝产量及活性物质成分的影响，试图开发富锌灵芝产品，让人们在食用灵芝产品时，既能吸收灵芝原本具有的药效成分，又能补充适量的生物锌并加强对锌元素的有效吸收，免受直接补充无机锌导致的副作用；同时，还为灵芝高产优质栽培技术寻求科学依据，具有重要的科学价值和生产指导意义。

樊德金等[3]栽培韩芝时，添加ZnSO4·7H2O至发酵培养基进行富锌试验，结果表明，培养基初始pH 5.5，每250毫升装液量为125 mL，培养13 d，韩芝富锌率最高，达到40.1%。刘坤等[5]采用液体培养方法比较了灵芝、灰树花和姬松茸的富锌能力，结果表明灵芝的富锌能力最强，培养液的锌浓度为240 mg·L-1时菌丝Zn含量达到6.42 mg·g-1，富锌率达30.39%，因此认为灵芝较适合作为富锌的载体。毕静莹等[6]在锌含量为500.0 mg（以锌元素计）的基础发酵液基础上开展了氮源和碳源筛选试验，发现玉米粉、豆粕和KH2PO4是影响日本灵芝（Ganoderma japonicum）富锌能力的主要因素，在组分为玉米粉35.0 g · L-1、豆粕7.0 g·L-1和KH2PO41.0 g ·L-1的条件下，日本灵芝富锌率最高可达25.1%。魏赛金等[7]研究表明，PDA培养基中ZnSO4·7H2O浓度为500 μ g·L-1时灵芝菌丝体生长状况最佳，第6天时菌落直径达到8.0 cm；ZnSO4·7H2O浓度为1000 μg ·L-1时菌丝体生长明显受到抑制；ZnSO4·7H2O浓度为300 μg·L-1时菌丝体的富锌能力最强，含锌量高达25.09 mg·g-1，胞外多糖含量最高为57%。杨泽涛等[8]以添加一定量ZnSO4的PDA培养基培养卫星灵芝2号菌株（satelliteGanoderma lucidum），结果表明在锌浓度为150 μg·L-1的PDA培养基中，28℃恒温培养5 d，菌落直径最大，为8.00 cm，菌丝体长势较对照组洁白、粗壮、密集；在ZnSO4浓度为60 μg·L-1的液体培养基中菌丝体的锌含量和富锌转化率最高，分别为1142.91 mg·L-1和1.76%。综上，目前相关研究多采取液体发酵培养开展试验，且主要涉及2个方面，一是初步探讨了灵芝在不同锌浓度的PDA培养基上的菌丝生长情况或菌丝对锌浓度的耐性；二是采取液体发酵培养灵芝，研究了菌丝体富集锌的能力或效果。

本研究中，采取在固体栽培基质中添加外源锌开展试验，探讨不同锌含量的固体栽培基质对灵芝的菌丝生长、子实体产量及其活性物质成分和子实体富锌影响的研究，目前此类研究鲜见报道。设计不同Zn含量处理培养基质栽培灵芝，观测各个处理的菌丝生长速度及子实体产量，测定子实体中多糖、三萜和Zn含量，筛选出促进灵芝生长发育和提高活性成分的栽培基质中锌的适宜添加浓度，以丰富灵芝高效栽培应用技术和优质栽培技术指标参数。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

灵芝品种“川圆芝1号”，由四川省农业科学院土壤肥料研究所微生物研究室提供。

1.1.2 基础培养基

基质配方：90%棉籽壳、5%麦麸、4%玉米粉、1%石膏，含水量68%， pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

预先将醋酸锌（ZnAC）溶解于水，再将ZnAC水溶液添加于基础培养中，使ZnAC在培养基质中的最终含量分别为0 （CK）、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、150 mg·kg-1、200 mg·kg-1、250 mg·kg-1、300 mg·kg-1、350 mg·kg-1，即设置 CK、Zn-50、Zn-100、Zn-150、Zn-200、Zn-250、Zn-300、Zn-350共计8个试验处理。每个处理设置3个重复组，每个重复组10个菌袋，合计30袋。

1.2.2 栽培方法

采用灵芝熟料袋栽荫棚出芝方法开展本试验，按照灵芝代料栽培技术的工艺流程进行培养料配制、装袋、灭菌、接种、发菌和出芝管理等[9]。其中，栽培料袋使用聚丙烯塑料袋，料袋规格（长度×折径×厚度）为 33.000 cm×17.000 cm×0.005 cm；装干料0.55 kg/袋，常压灭菌18 h；接种后在（25±2）℃条件下发菌，待菌丝满袋后搬入出芝棚；当子实体边沿黄白色生长圈消失，开始弹射孢子时采收子实体。

1.3 测定方法

1.3.1 菌丝生长速度

以菌丝体在单位时间内于培养基质中伸长的长度作为菌丝生长速度，即在菌丝体生长到菌袋约1/4时，在菌袋上菌丝体边缘处用记号笔画出生长起始线，培养15 d后在菌袋上画出生长截止线，测量起始线与截止线之间的直线长度，即可计算出菌丝平均生长速度（mm·d-1）。

1.3.2 多糖含量

参照《中华人民共和国药典》中灵芝“多糖测定法”测定样品中的多糖含量[4]：称取已打磨成细粉的灵芝样品1 g，加入30 mL的水于90℃的水浴锅中提取3 h，然后在离心机中以4000 r·min-1的速度离心10 min，得滤液1；将滤渣再次水提，加入20 mL的水于90℃的水浴锅中提取2 h，然后在离心机中以4000 r·min-1离心10 min，得滤液2；将滤液1和2合并，通过旋转蒸发仪浓缩至约10 mL，得浓滤液；加入浓滤液3倍体积的95%乙醇，过夜沉淀，4000 r·min-1离心10 min，取沉淀物（粗多糖），再加水溶解定容至10 mL；按照紫外-可见分光光度法（通则0401），在490 nm波长处测定吸光度，设置空白，制作标曲， 测定供试品溶液中无水葡糖糖的含量，计算后即得样品中多糖含量。

1.3.3 三萜含量

参照《中华人民共和国药典》中灵芝“三萜测定法”测定样品中的三萜含量[4]：称取已打磨成细粉的灵芝样品2.0 g，置于具塞锥形瓶中，加无水乙醇50 mL，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）45 min；过滤，滤液置 100 mL量瓶中；用适量乙醇分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一量瓶中；加乙醇至刻度，摇匀，即得取供试品溶液；精确量取供试品溶液2 mL，置15 mL具塞试管中，放冷，精确加入新配制的香草醛冰醋酸溶液 2 mL（精确称取香草醛 0.5 g，加冰醋酸溶解，定容为10 mL）、高氯酸8 mL，摇匀；在70℃水浴中加热15 min，立即置于冰浴中冷却5 min；取出，精确加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，避光反应20 min；按照紫外-可见分光光度法（通则0401），在546 nm波长处测定吸光度，设置空白，制作标曲，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，计算，即得样品中三萜含量。

1.3.4 锌含量

参照GB 5009.14-2017《食品安全国家标准 食品中锌的测定 第一法 火焰原子吸收光谱法》测定锌含量。样品去除杂物后，粉碎，储于塑料瓶中。准确称取灵芝子实体试样2.000 g（精确至 0.001 g）于坩埚中，小火加热，炭化无烟，转移至马弗炉中，于550℃灰化3 h～4 h 。冷却，取出，对于灰化不彻底的试样，加数滴硝酸小火加热，小心蒸干，再转入550℃马弗炉中，继续灰化1 h～2 h，至试样呈白灰状，冷却，取出，用适量硝酸溶液1 ：1溶解并用水定容至25 mL。设置空白，在与测定标准溶液相同的试验条件下，将空白溶液和试样溶液分别导入火焰原子化器，原子化后在213.9 nm波长处测定吸光度，通过标准曲线计算，即得样品中锌含量。

1.4 数据处理

利用SPSS 20数据处理软件，对各个处理间的菌丝生长速度、子实体产量、多糖含量和三萜含量等数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 灵芝在不同锌含量基质上的菌丝生长速度

川圆芝1号在8个处理的培养基质 上，菌丝平均生长速度和子实体（干重）单产见表1。

表1 川圆芝1号在不同锌含量培养基质上菌丝生长速度和子实体产量Tab.1 Mycelial growth rates and yields of Chuanyuanzhi No.1 on formula materials with different zinc contents

由表1可知，各处理中菌丝的生长速度范围为 5.70 mm·d-1～ 6.53 mm·d-1，生长速度由慢至快顺序 为 CK（5.70 mm·d-1）＜Zn-100(5.80 mm·d-1)＜Zn-300（5.90 mm·d-1）＜Zn-200（5.97 mm·d-1）＜Zn-350（6.07 mm·d-1）＜Zn-50 （6.13 mm·d-1）＜Zn-250（6.48 mm·d-1）＜Zn-150（6.53 mm·d-1）。结果表明，灵芝在基础培养基中添加锌元素后各处理的菌丝生长速度均高于CK，其中Zn-150（6.53 mm·d-1）处理的菌丝平均生长速度最快，与Zn-200、Zn-350处理呈显著性差异，与CK、Zn-100、Zn-300的差异达极显著水平。可见，基质中添加外源锌（醋酸锌）可促进菌丝生长速度，在Zn-150时生长速度最快，较CK菌丝生长速度提高了约14.6%。

各处理子实体平均单产为24.38 g/袋～35.57 g /袋，由低到高的顺序为Zn-300（24.38 g/袋）＜CK（27.33 g/袋）＜Zn-50（28.35 g/袋）＜Zn-200（29.06 g/袋）＜Zn-250（29.50 g/袋）＜Zn-350（33.29 g/袋）＜Zn-150（34.07 g/袋）＜Zn-100（34.57 g/袋）。其中，除 Zn-300（24.38 g/袋）处理的单产低于CK外，其余处理的单产均高于CK；其中，Zn-100（34.57 g/袋）处理的单产最高，但较CK差异不显著。由此可见，基质中添加外源锌（醋酸锌）对灵芝子实体产量影响不显著。

2.2 灵芝在不同锌含量基质上的子实体多糖、三萜含量及子实体富集锌含量

川圆芝1号在供试8个处理的培养基质上子实体多糖含量、三萜含量及子实体锌含量见表2。

表2 川圆芝1号在不同锌含培养基质中所产子实体多糖、三萜含量及锌含量Tab.2 The contents of polysaccharides, triterpenoids and zinc contents of Chuanyuanzhi No.1 on formula materials with different zinc contents

由表2可知，各处理中子实体的多糖含量范围为1.24%～2.25%，由低至高顺序为Zn-50（1.23%）＝Zn-150（1.23%）＜ Zn-100（1.47%）＜ Zn-250（1.62%）＜Zn-200（1.75%）＜Zn-350（1.79%）＜CK（2.14%）＜ Zn-300（2.25%）。其中， 除 Zn-300（2.25%）处理外，其余添加锌基质处理子实体中多糖含量均低于CK；Zn-300处理与CK、Zn-350、Zn-200、Zn-250相比差异不显著，但与Zn-50、 Zn-100、 Zn-150处理相比差异显著。因此，在基质中添加外源锌（醋酸锌）对灵芝子实体中多糖的形成和含量积累的影响不明显。

各处理中子实体的三萜含量为2.10%～3.68%，由低至高顺序为Zn-200（2.02%）＜Zn-250（2.10%）＜CK（2.46%）＜Zn-300（2.63%）＜Zn-150（2.82%）＜Zn-100（2.88%）＜Zn-350（3.50%）＜Zn-50（3.68%）。其中，Zn-50（3.68%）处理子实体中的三萜含量最高，且较CK、Zn-250处理的差异达显著水平，较Zn-200的差异达极显著水平。结果表明，在基质中添加外源锌（醋酸锌）会诱导和促进子实体中三萜的形成，且添加锌含量为50 mg·kg-1时会显著提高子实体中的三萜含量，较CK子实体中的三萜含量提高了约52.1%。

各处理中子实体的锌含量范围为25.30 mg·kg-1～48.53 mg·kg-1，由低至高顺序为 CK（25.30 mg·kg-1）＜ Zn-150（30.60 mg·kg-1）＜Zn-50（31.77 mg·kg-1）＜ Zn-100（33.93 mg·kg-1）＜Zn-200（mg·kg-1）＜ Zn-250（35.47 mg·kg-1）＜Zn-300（40.37 mg·kg-1）＜Zn-350（48.53 mg·kg-1）。结果显示，灵芝在基质中添加醋酸锌的各处理的子实体锌含量均高于CK，其中Zn-350（48.52 mg·kg-1）处理子实体含锌量最高，较其他处理间差异极显著，且较CK的锌含量提高了91.81%。综上所述，在栽培基质中添加外源锌（醋酸锌）能够促进灵芝子实体锌含量的富集，可见，灵芝子实体对醋酸锌中的锌离子具有很强的富集能力。

3 讨论

3.1 在固体栽培基质中添加外源锌（醋酸锌）可促进灵芝菌丝生长

在以棉籽壳为主料的固体栽培基质中添加50 mg·kg-1～350 mg·kg-1的醋酸锌，均具有良好的促进灵芝菌丝生长的效果。这与魏赛金等[7]和杨泽涛等[8]在PDA固体培养基中添加一定量硫酸锌后提高灵芝菌丝生长速度的试验结果一致。本试验结果，为缩短灵芝发菌周期提供了一项添加外源锌的栽培技术措施和对应技术指标参数，建议灵芝代料栽培者可在栽培基质中添加150 mg·kg-1的醋酸锌，以达到提高菌丝生长速度、缩短发菌周期的目的。本试验结果还表明，培养基质添加醋酸锌后，各个处理的灵芝子实体（干重）单产较CK差异不显著，即对灵芝单产没有显著影响。

3.2 在固体栽培基质中添加外源锌（醋酸锌）可提高灵芝子实体中三萜成分含量

在以棉籽壳为主料的固体栽培基质中添加醋酸锌，尽管对灵芝子实体中多糖的形成和含量积累的影响不大，但对子实体中三萜活性物质的诱导形成和含量积累产生了重要影响，且当添加锌浓度为50 mg·kg-1时大幅度地提高了子实体中的三萜含量。黄艳娟等[10]综述了灵芝三萜具有抗肿瘤、抗病原菌、降血脂、抗炎症反应、免疫调节、促进智力和延缓衰老等药理学作用。邢康康等[11]综述了灵芝酸具有拟癌、抗病毒、拟致病菌、防治心血管疾病、保护肝脏和防治癫痫等药理作用。生产含有灵芝活性物质产品的厂家希望以三萜物质含量较高的子实体作为提取原料，以获取更多的三萜物质。本试验研究结果，为栽培高三萜含量灵芝提供了一项添加外源锌的栽培技术和对应技术指标参数，建议灵芝代料生产者若以获取高三萜活性物质含量子实体为栽培目的，可在栽培基质中添加50 mg·kg-1醋酸锌。

3.3 在固体栽培基质中添加外源锌（醋酸锌）极利于灵芝子实体对锌的富集

在以棉籽壳为主料的的固体栽培基质中添加醋酸锌，能够大幅度促进灵芝在子实体中锌的富集，说明灵芝子实体具有很强的锌富集能力，可通过生物强化途径研发出富锌灵芝子实体产品。这与刘坤等[5]研究结果灵芝菌丝体富集锌率高，并认为灵芝较适合作为富锌生物体的结果类似。生物有机锌产品市场前景好，灵芝产品生产厂家需要具有高多糖和高三萜含量又兼具高锌含量的灵芝子实体，作为加工原料。因此，本试验研究结果，既为富锌灵芝栽培提供了一项添加外源锌的栽培技术和对应技术指标参数，又为通过栽培方法调整来获得富锌灵芝子实体以研发新产品奠定了理论基础。综上所述，建议灵芝代料生产者若以获取富锌子实体产品为栽培目的，可在栽培基质中添加醋酸锌350 mg·kg-1。