基于近红外技术的蛹虫草成分快速定量分析研究*

马 健，李尽哲

（信阳农林学院，河南 信阳 464000）

蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北蛹虫草，为子囊菌门（Ascomycota）肉座目（Gibberella fujikuro）麦角菌科（Clavicipitaceae）是一种昆虫病原真菌。蛹虫草在很久以前就被东方国家发现，它不仅具备很高的营养价值，还拥有珍贵的药用功效。赵学敏在《本草纲目拾遗》中把虫草类的药用归之为“能治百虚百损”；李时珍在《本草纲目》中指出，蝉花能主治“小儿天吊惊痛，夜啼，心悸”。其中蝉花包括蝉草和蛹草等多种寄生于蝉体上的虫草。由此可见，蛹虫草的药用价值之高。蛹虫草中含有腺苷、蛋白质、多糖、虫草酸等多种有效成分，在降血脂、抗菌、抗癌、抗衰老等方面都有显著的功效[1]。蛹虫草与冬虫夏草属同属真菌，是虫草属的模式种。研究结果表明，蛹虫草含有的活性物质及其药理作用接近甚至超过冬虫夏草[2]。现行常用的腺苷测定方法高效液相法、蛋白质测定方法是凯氏定氮法、虫草酸测定方法是比色法、多糖测定方法是蒽酮-硫酸法，这些方法都具有测定过程复杂、材料消耗大及分析时间长等缺点。在使用上述方法分别对蛹虫草成分进行测定的过程中，会造成大量不可避免的损耗。而且蛹虫草具有自然资源较少、价格昂贵、人工培养难等特点[3]，近年来，还在食品方面的开发利用上取得了很大的进展。由此，能对样品进行无损检测、成本低、分析速度快、效率高、能多组分同时检测的近红外技术进入了蛹虫草成分研究的领域。

近红外技术全称叫近红外光谱技术，近红外光谱属于分子振动光谱，美国试验和材料协会（ASTM）将其定义为波长在780 nm～2526 nm范围内的电磁波，主要反映分子中C-H，N-H与O-H基团的振动倍频和合频吸收。它具有易于采集和处理、吸收弱以及信息丰富等特点。近红外光谱是人们最早发现的可见光区域，但由于吸收信号弱，谱带重叠，解析复杂等原因，受到当时技术水平的限制，它几乎沉睡了一个半世纪。从20世纪50年代至今，经过科学家们的不懈努力，科学技术的不断发展繁荣，也使近红外光谱的相关研究几乎呈指数增长，近红外光谱技术在各个领域得到了有效应用，并且取得了良好的社会效益和经济效益。近红外光谱技术在食品、药材及化工产品领域都得到了广泛的应用，在中药材的成分鉴定和成分提取中具有不可取代的优点。利用近红外技术，还能够对中药的产地和质量差别进行区分。基于近红外技术，通过对蛹虫草的成分进行快速定量分析研究。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

优质人工栽培的蛹虫草1株，通过化学诱变法获得278株诱变蛹虫草菌株。各项性能长期稳定的近红外光谱分析仪，采用SPSS软件和Excel软件进行数据处理与分析。

1.2 方法

采用近红外光谱分析技术定量分析的方法，方法步骤分为三步，分别是选取代表性样品，测量其近红外光谱；数据采集，采用标准或认可的参考方法测定所关心的组成数据或性质数据；建模，通过合理的化学计量学方法建立数学模型。由于散射效应等因素对光谱会有干扰，为了消除影响，需要对光谱进行预处理。本研究采用FFT、卷积平滑法、一阶导数、二阶导数、小波变换等不同的预处理方法对光谱进行预处理。

2 结果与讨论

2.1 校正集与预测集的选择

为了取得更好的预测结果，在校正时要求试验者适当设计校正集样品和预测集样品。本试验以210株蛹虫草样品作为校正集，68株蛹虫草样品作为预测集，将两样品集均匀分布，校正集样品与预测集样品中各有效成分测定含量统计结果，见表1所示。

表1 蛹虫草有效成分的质量含量统计Tab.1 Statistics on the quality content of active constituents of Cordyceps militaris

2.2 建立最优模型

由于在近红外光谱分析中原始光谱会受到杂噪音和基线飘移的干扰，对蛹虫草成分的分析效果可能不佳。为了建立最优模型，本研究采用了多种不同的光谱预处理方法，从窗口大小、尺度大小、不同宽度和不同主因子数方面对蛹虫草的成分进行比较分析，结果见表2所示。

表2 各种预处理方法对PLS模型的影响Tab.2 Effect of various pretreatment methods on the PLS model

比较各个模型发现，各模型的内部交互验证均方根误差（RMSECV）、交互验证预测值与真实值间的相交系数（RV）以及外部预测均方根误差（RMSEP）的差别很小。保留了小数点后4位数字，才能看到细微的差别。为了建立最优模型，研究者对经过不同预处理的光谱进行了如下的选择：FFT预处理后建立的蛋白质PLS定量分析模型的拟合效果比其他预处理后建立的模型好，RV= 0.9146，但是预测能力不如小波变换预处理后的强（RMSEPFFT= 0.6075＞RMSEP小波= 0.6018），选择小波变换预建立蛋白质PLS定量分析模型；小波变换的腺苷定量分析PLS模型的拟合效果略高于其他预处理建立的模型，RV= 0.9771，但是预测能力不及卷积平滑法建立的腺苷PLS定量分析模型（RMSEP小波= 0.0261＞RMSEP卷平= 0.0189），选择卷积平滑法建立腺苷PLS定量分析模型；虫草酸在一阶导数预处理后建立的PLS定量分析模型的拟合效果不是最好的，但是预测能力优于其他处理后建立的模型；蛹虫草的多糖成分在经过卷积平滑法预处理后，不管是稳定性还是拟合效果和预测能力（RMSECV= 0.0086，RV= 0.8891，RMSEP= 0.0085），建立的PLS定量分析模型都比其他方法处理后建立的模型好。选定最优模型归纳整理后，与原始光谱建立的PLS定量分析模型比较，如表3所示。

表3 原始光谱建立的PLS模型与预处理的最优模型对比Tab.3 Comparison of the PLS model established by the original spectrum with the optimal model of the pretreatment

由表3可知，就蛹虫草中的蛋白质成分而言，原始光谱建立的PLS定量分析模型的拟合度效果优于经过预处理后建立PLS定量分析模型（RV原= 0.9771＞RV最= 0.9083），预测能力也比经过预处理后建立的PLS定量分析模型强（RMSEP原= 0.5670＜RMSEP最= 0.6018），所以在蛋白质成分上，原始光谱建立的定量分析模型优于采用预处理方法后建立的模型；原始光谱对腺苷成分的PLS定量分析模型拟合度效果比预处理后PLS定量分析模型的拟合效果差（RV原=0.9014＜RV最= 0.9743），预测能力也不如预处理过后的PLS定量分析模型（RMSEP原= O.0203＞RMSEP最= 0.0189），因此腺苷在预处理后建立的PLS定量分析模型优于原始光谱的；虫草酸在原始光谱建立的PLS定量分析模型中拟合度效果（RV原= 0.8807＞RV最= 0.8754）比预处理后的略好，而且预测能力（RMSEP原= 0.0082＜RMSEP最= 0.0083）也比预处理后的模型好，在虫草酸成分的定量分析中，由原始光谱建立的模型更好些；多糖在原始光谱的PLS定量分析模型中拟合度效果（RV原= 0.8871＞RV最= 0.8819）略好于预处理后建立的PLS定量分析模型，但考虑到预测能力（RMSEP原=0.0091＞RMSEP最= 0.0085）不及预处理后建立的模型，所以预处理后的模型在多糖的定量分析上优于原始光谱建立的模型。

从上面的分析中，很难辨别蛹虫草的成分定量分析是使用原始光谱分析建立模型好，还是需要经过预处理才能得到更好的定量分析模型。王迪等人关于近红外光谱技术在蛹虫草菌丝体分析中的研究认为，应用预处理方法消除了光谱中的随机噪音、基线和其他背景干扰后，建立的PLS定量分析校正模型的稳定性、拟合效果和预测能力会有显著提高。但是在两者的分析效果差异不显著的情况下，不对光谱进行预处理，直接使用原始光谱对蛹虫草成分定量分析，会减少很多时间，提高效率和速度。

2.3 原始光谱建立模型的内部交互验证

为了评价以原始光谱建立的模型的稳定性和拟合效果，对原始光谱建立的PLS定量分析模型进行内部交互验证，结果见图1所示。

图1 原始光谱建立的模型的内部交互验证Fig.1 Internal interaction verification of the model established by the original spectrum

从图1中可知，多糖的内部交互验证RMSECV为0.0091，预测值与真实值间的相交系数（RV）为0.8871，图上的点大致均匀的分布在直线周围并无限趋近直线。蛋白质、虫草酸以及腺苷的数值和分布状况也很良好，这说明预测值与真实值很接近，以原始光谱建立的PLS定量分析模型的稳定性和拟合效果非常好。

2.4 预测集原始光谱建立模型的外部验证

外部验证一般采用与参与定标的样品品质相似，但是还没有使用过的样品，这里使用了预测集样品，通过比较预测集样品的预测值与试验测定值的差异来判断模型的预测准确性，结果见图2。

图2 预测集样品原始光谱建立模型的外部验证Fig.2 External verification of the original set model of the prediction set sample

由图2可知，对预测集中的蛹虫草成分不做任何预处理，利用近红外光谱分析仪直接对它进行定量分析、建模，对建立的模型进行外部验证， 蛋白质、虫草酸、腺苷和多糖成分的外部预测均方根误差（RMSEP）分别为0.0196、0.0087、0.5780、0.0079。试验结果表明，由原始光谱建立的蛹虫草成分定量分析模型有很好的预测能力。该结果与王迪等人的实验结果一致[4]。

3 结论

近红外技术可以多组分、快速、同时、准确地对蛹虫草成分进行定量分析。可以减少用高效液相法、凯氏定氮法、比色法和蒽酮-硫酸法等分别对蛹虫草主要有效成分进行定量分析带来的对材料损耗大、时间长、效率低等问题，也不需要对光谱进行程序复杂的预处理。使用近红外光谱技术定量分析蛹虫草有效成分，能够损耗小、更快速、更准确使蛹虫草有效成分得到更大价值的利用，造福更多的人。