牦牛酥油磷脂提取工艺研究及脂肪酸成分分析

雷有娟,孙万成,罗毅皓

（青海大学农牧学院，西宁810016）

0 引言

牦牛酥油是牧民用传统手工从新鲜的牦牛奶中提炼出的一种乳制品，夏季或秋季从牦牛乳中提炼出的酥油呈鲜黄色，而冬季牦牛酥油则呈奶白色，其主要成分为脂肪和水分，还有少量的蛋白质。苟钰姣[1]等发现牦牛乳中功能性脂肪酸含量显著高于普通牛乳，并且许多在牦牛原乳中能检测到的饱和脂肪酸在酥油中未检测到。牦牛酥油中比例最高的脂肪酸依次为棕榈酸、油酸、硬脂酸和肉豆蔻酸[2]。众多研究表明[3-5]，酥油含有多种功能性脂肪酸，例如：亚油酸(CLA)、花生四烯酸(AA)、α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。

磷脂包括鞘磷脂和甘油磷脂两大类，甘油磷脂磷包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酸(PA)等[6]。它不仅具有较高的营养价值，还具有调节代谢、预防血管疾病和动脉硬化、延缓衰老等功能[7-9]。乳源磷脂与其他植物来源磷脂的一个重要区别是，乳源磷脂含有鞘磷脂[10]，目前牛乳脂肪中发现了五种磷脂，含量最高的是PE、PC和SM，其次是PI和PS[11-13]。磷脂的提取方法包括有机溶剂萃取法、超临界萃取法、柱层析、膜分离法等[14]。磷脂易溶于乙醇、氯仿、正己烷等有机溶剂，不溶于丙酮，所以被称为丙酮不溶物，根据这种特性可对磷脂化合物进行初步分离提纯[15]。一般是将溶解和沉淀两种手段结合使用。我国对磷脂的提取主要集中在大豆、蛋黄和鱼下脚料等的提取，而在牦牛酥油中提取几乎未见报道。本文采用溶剂提取法对牦牛酥油的磷脂进行提取并对其脂肪酸组成进行分析。

1 实验

1.1 仪器

双光束紫外可见分光光度计(UV—2600)，日本岛津公司；电热恒温水浴锅,上海比朗仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）、旋涡混合器（M VS-1），北京东方开物科学器材有限公司；恒温震荡器(THZ-82)，常州国华电器有限公司；医用离心机（LC-04C），江苏正基仪器有限公司；气相色谱质谱联用仪（Trace DSQ），赛默飞世尔科技公司；电子天平(JM-B 3003)，诸暨市超泽衡器设备有限公司。

1.2 试剂

牦牛酥油购自青海省祁连县野牛沟牧民家；正己烷、丙酮、磷酸二氢钾、钼酸铵、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠盐、抗坏血酸、98%浓硫酸、高氯酸、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醇、甲醇、氢氧化钾、酚酞指示剂、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯；水为去离子水；三氟化硼甲醇，成都艾科达化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛酥油中磷脂的提取方法

精密称取牦牛酥油2 g于50 m L离心管中，加8 m L正己烷，45℃下水浴1 h（漩涡震荡使酥油中的磷脂充分溶解），之后在3 000 r/m in的转速下离心10 m in,取上清液于另一干净的50 m L离心管中，加入丙酮浓缩磷脂，丙酮的添加量为溶液开始变浑浊或者开始产生沉淀时停止加入（大约是上清液体积的2～3倍），震荡均匀后在4℃冰箱中静置约25 h。底部沉淀就是粗磷脂，用移液枪吸出上清液，离心，分离出离心管底部粗磷脂后用氮气吹干，得到磷脂产品,于-20℃冷冻保存。

1.3.2 牦牛酥油磷脂得率计算

式中：m1为提取物质量，g；m2为牦牛酥油原料质量，g。

1.3.3 磷脂纯度的测定

采用抗坏血酸-钼蓝法[16]测定牦牛酥油提取物中总磷脂，磷脂纯度计算公式如下：

式中：m为提取物中的含磷量，g；w为测定样品所用提取物的质量，g；26.3—每毫克磷相当于磷脂的毫克数。

1.3.4 试验设计

1.3.4.1 单因素试验设计

取白色和黄色牦牛酥油，固定提取条件：液固比4 m L/g，正己烷提取时间60 m in，提取温度45℃，丙酮沉淀时间25 h,当其他因素不变时，改变单一因素，以正己烷浸提磷脂的得率和纯度为指标，分别探讨液固比（3、4、5、6、7 m L/g）、提取时间（30、40、50、60、70 m in）、提取温度（35、40、45、50、55℃）、丙酮沉淀时间(15、20、25、30、35 h)4个因素对正己烷浸提磷脂提取效果的影响。

1.3.4.2 正交试验设计

根据单因素试验结果，以液固比、提取时间和提取温度为因素，各选出3个水平设计三因素三水平的L9(34)正交试验，以确定正己烷浸提粗磷脂的最佳工艺参数,因素水平见表1。

表1 正正交试验因素水平表

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 样品甲酯化

取0.5 g牦牛酥油粉末磷脂于具塞试管中，加入10 m L甲醇和1 g氢氧化钾，盖住瓶口，于65℃恒温震荡培养2 h。取出冷却后，加入浓盐酸酸化至pH为2～3，再加入10 m L正己烷，震荡均匀，静置10 m in待其分层，取正己烷层（上层）于另一干燥试管中，用氮气干燥正己烷，获得干燥的游离脂肪酸。加入质量分数为15%的BF31 m L，90℃水浴2 h；取出冷却后，移入离心管中，加2 m L正己烷，震摇，3 500 rpm离心2 m in，取正己烷层氮气吹干，进行GC分析。

1.3.5.2 GC-M S分析

柱子型号DB-5M S 60m×0.25mm×0.25μm广州费尼根仪器有限公司；色谱柱：柱子型号为ZB-5M S 60 m×0.25 mm×0.25μm。程序升温条件：初始温度60℃，保持1 m in；以10℃/m in，升温至180℃，保持0 m in，以4℃/m in，升温至280℃，保持10 m in，以20℃/m in，升温至300℃，保持2 m in；载气：高纯H e(99.999%)，进样口温度：280℃，进样量：1.0 m L/m in，传输线温度：285℃；离子源温度：250℃；溶剂延迟时间7 m in。质量扫描范围：40～550 u。

2 结果分析

2.1 检测波长选择

在500～900 nm波长每隔10 nm测定吸光度值，在819 nm处有最大吸收，故选择819 nm作为检测波长。

图1 波长选择

2.2 磷标准曲线

图2 磷含量标准曲线

2.3 单因素试验结果

2.3.1 提取时间对牦牛酥油磷脂得率与纯度的影响

图3 提取时间对牦牛酥油磷脂提取效果的影响

提取时间对牦牛酥油磷脂得率与纯度的影响如图3所示，随着提取时间的延长,牦牛酥油磷脂得率和纯度先增加后趋于平缓。当提取时间为60 m in时，黄酥油与白酥油的磷脂得率最高，分别为6.30%和5.47%。当提取时间为50 m in时，黄酥油与白酥油的磷脂纯度最高，分别为58.08%和53.16%。当提取时间高于60 m in后，正己烷中溶解度不大的物质的溶解量逐渐积累、増加，最终导致磷脂纯度的下降。因此，综合考虑提取时间在50～60 m in为宜。

2.3.2 提取温度对牦牛酥油磷脂得率与纯度的影响

提取温度对牦牛酥油磷脂得率与纯度的影响如图4所示，随着提取温度的升高,牦牛酥油磷脂得率和纯度先增加后趋于平缓。白酥油和黄酥油的磷脂得率在35℃～50℃之间呈上升趋势，50℃时磷脂得率最高，分别为6.30%和5.71%，当大于50℃时得率开始下降。而白酥油和黄酥油的磷脂纯度在35℃～45℃之间呈上升趋势，45℃时磷脂纯度最高，分别为63.56%和55.36%，当大于45℃时纯度有所下降，但都在50%以上。这可能是由于温度的升高，使溶解度增大，所以在一定温度范围内，牦牛酥油磷脂得率与纯度均增加。但温度过高，会导致其他杂质如色素等的溶解，产品纯度下降，但随温度继续升高到一定程度后，磷脂分子在正己烷中的溶解度达到平衡，并且料液间气化层的形成，阻碍溶剂进入，导致得率下降。因此，综合考虑提取温度在45℃～55℃为宜。

图4 提取温度对牦牛酥油磷脂提取效果的影响

2.3.3 液固比对牦牛酥油磷脂得率与纯度的影响

图5 液固比对牦牛酥油磷脂提取效果的影响

正己烷用量与牦牛酥油质量之比对磷脂得率与纯度的影响如图5所示，随着液固比的增加,磷脂得率先增加后趋于平缓。当正己烷用量与牦牛酥油液固比为5∶1时,黄酥油与白酥油的磷脂得率最高,分别为6.41%和5.47%。可能是正己烷用量的增多，导致牦牛酥油与溶剂接触面积的增大，促进磷脂的溶出，得率增加。但当液固比超过5 m L/g时，提取能力达到饱和，过量的正己烷只能造成资源的浪费。随着液固比的增加,磷脂纯度也是先增加后趋于平缓。当正己烷用量与牦牛酥油液固比为6∶1时,黄酥油与白酥油的磷脂纯度最高，分别为51.3%和53.78%。但由于正己烷用量增大到一定程度，一些非磷脂成分在溶液中的溶解度升高，导致纯度下降。因此，综合考虑磷脂的得率和纯度，液固比在5～6 m L/g为宜。

2.3.4 丙酮沉淀时间对牦牛酥油磷脂得率与纯度的影响

丙酮沉淀时间对牦牛酥油磷脂得率与纯度的影响如图6所示，随着去油时间的延长，磷脂得率和纯度先增加后趋于平缓。白酥油和黄酥油的磷脂得率在15～25 h之间呈上升趋势，25 h时磷脂得率最高，分别为6.30%和5.47%，当大于25 h时磷脂得率趋于平缓。而白酥油和黄酥油的磷脂纯度在15～30 h之间呈上升趋势，30 h时磷脂纯度最高，分别为50.28%和52.05%，当大于30 h时纯度趋于平缓。这可能是由于随着丙酮沉淀时间的延长，除油率随之增大，当时间继续延时，丙酮挥发溶解的中性油又析出，使得纯度降低，因此，确定除油时间为25 h。

表2 正交试验因素水平表

图6 丙酮沉淀时间对牦牛酥油磷脂提取效果的影响

2.4 正交试验结果

根据单因素试验对提取工艺的初步探索，进行正交试验。考虑到丙酮沉淀时间30 h时，提取得到的磷脂其提取率和纯度均较好，本研究将丙酮沉淀时间固定为30 h，着重探讨提取时间、提取温度、液固比的影响，各选出三个水平，设计了三因素三水平的L9(34)的正交试验，试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

由正交表可知，黄酥油磷脂得率的直观分析结果显示，最佳提取条件为A2B2C2，各因素对磷脂得率的影响主次顺序为C＞A＞B；黄酥油磷脂纯度的最佳提取条件为A3B3C3，各因素对磷脂纯度的影响主次顺序为A＞C＞B；考虑在产品质量为首要目标，同时尽可能保证产品的得率，因而磷脂纯度的直观分析结果成为首选。因此本研究优先考虑磷脂纯度指标，液固比选择6 m L/g，提取温度选择55℃，而考虑到提取时间对磷脂得率和纯度影响都不大，但是当提取时间为60 m in时磷脂的得率和纯度都相对较高，并且与单因素试验结果相符合，因此，综合考虑黄酥油提取最优组合为A3B2C3，即最佳试验条件为：液固比6 m L/g，提取时间60 m in，提取温度55℃。

白酥油磷脂得率的直观分析结果显示，最佳提取条件为A1B2C3，各因素对磷脂得率的影响各因素的主次顺序为A＞B＞C。磷脂纯度最佳提取条件为A3B2C1，各因素的主次顺序为C＞B＞A。同理，优先考虑磷脂纯度指标，液固比选6 m L/g，提取时间选择60 m in，提取温度选择55℃。综合考虑白酥油提取最优组合为A3B2C1，即最佳试验条件为：液固比6 m L/g，提取时间60 m in，提取温度45℃。

2.5 验证试验

对最优工艺条件进行验证，在A3B2C3和A3B2C1条件下分别对黄酥油和白酥油进行3次平行试验，黄酥油磷脂得率为6.74%，纯度为62.96%，白酥油磷脂得率为4.97%，纯度为58.09%。该结果在保证产品品质的同时，得到较高的得率。

2.6 酥油脂肪酸组成的气相色谱-质谱联用分析

对牦牛酥油以及经正己烷提取丙酮沉降后的磷脂，进行脂肪酸组成分析，结果如表3所示。牦牛酥油中检出36种脂肪酸，其中饱和脂肪酸26种，白色和黄色牦牛酥油饱和脂肪酸含量分别占脂肪酸总量的75.89%和73.73%，不饱和脂肪酸10种，由单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸组成，分别占脂肪酸总量的24.12%和26.27%。还有5种支链脂肪酸，分别占脂肪酸总量的9.1%和5.28%。主要的脂肪酸为肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸；单不饱和脂肪酸6种，分别占脂肪酸总量的23.10%和23.84%，多不饱和脂肪酸4种，分别占脂肪酸总量的1.02%和2.43%。

牦牛酥油磷脂中共检测出29种脂肪酸，其中饱和脂肪酸24种，白色和黄色酥油磷脂饱和脂肪酸含量分别占总量的94.28%和97.04%。不饱和脂肪酸5种，分别占脂肪酸总量的5.72%和2.96%。主要为肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。单不饱和脂肪酸4种，分别占脂肪酸总量的5.39%和2.25%，多不饱和脂肪酸1种，分别占脂肪酸总量的0.33%和0.71%。支链脂肪酸5种，分别占脂肪酸总量的3.95%和3.24%。

可以看出牦牛酥油与酥油磷脂相比，脂肪酸组成以及含量有较大差别。如酥油磷脂中支链脂肪酸、单不饱和脂肪酸和中链脂肪酸含量显著低于牦牛酥油中的含量；牦牛酥油中含有的多种不饱和脂肪酸(如EPA、DHA等)在酥油磷脂中并未检测出，并且牦牛酥油不饱和脂肪酸含量达24%以上，是酥油磷脂的五倍以上；酥油磷脂中饱和脂肪酸含量明显高于牦牛酥油中，尤其是棕榈酸和硬脂酸。现已有许多研究证明不饱和脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸具有多种生物学功能，如CLA具有抗肿瘤、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化形成、免疫调节等作用[17-18]；ALA具有降低胆固醇含量、保护视力、抑制衰老、降血脂的功能[19]，AA有助于婴幼儿的成长发育、降血脂、降血压和降血胆固醇[20]；EPA和DHA具有预防心血管疾病，抗炎抗过敏，健脑明目等作用[21]，有研究表明支链脂肪酸具有具有抗癌作[22-23]。由表3可以看出牦牛酥油中功能性脂肪酸种类丰富，含有油酸、CLA、AA、EPA、DHA等多种功能性成分，但AA、EPA、DHA在酥油磷脂中并未检测出。

表3 牦牛酥油及磷脂脂肪酸组成及相对含量 %

3 结论

通过单因素试验和正交试验确定出黄色牦牛酥油磷脂最佳提取的工艺为液固比6 m L/g，提取时间60 m in，去油时间25 h，提取温度55℃，在此工艺条件下粗磷脂得率为6.74%，纯度为62.96%；白色牦牛酥油最佳提取的工艺为液固比6 m L/g，提取时间60 m in，去油时间25 h，提取温度45℃，在此工艺条件下粗磷脂得率为4.97%，纯度为58.09%。对原料及产物经过气相色谱质谱联用分析脂肪酸组成，牦牛酥油中检出36种脂肪酸，其中饱和脂肪酸26种，占脂肪酸总量的73.73%～75.89%，不饱和脂肪酸10种，占脂肪酸总量的24.12%～26.27%；磷脂中共检测出29种脂肪酸，其中饱和脂肪酸24种，占脂肪酸总量的94.28%～97.04%，不饱和脂肪酸5种，占脂肪酸总量的2.96%～5.72%。牦牛酥油与酥油磷脂脂肪酸组成以及含量差别较大，酥油磷脂中支链脂肪酸、单不饱和脂肪酸和中链脂肪酸含量显著低于牦牛酥油；牦牛酥油不饱和脂肪酸含量是酥油磷脂的5倍以上，并且牦牛酥油中含有的多种不饱和脂肪酸(如EPA、DHA等)在酥油磷脂中并未检测出。本工艺成本较低，操作简单，易于产业化应用，以期为牦牛酥油磷脂提取工艺的研究提供基础数据。