不同浓度青藤碱抑制小细胞肺癌细胞系NCI-H446增殖及凋亡的作用研究

李林 慕玉东（通讯作者） 贺林 张涛 袁志敏 代佳 秦浩 刘斯扬

（1陕西省肿瘤医院 陕西 西安 710061）

（2西安市中心医院 陕西 西安 710003）

近年来，伴随着我国经济迅速发展及工业化进程不断加快，人口老龄化加剧，每年肺癌发病率也呈逐年上升趋势，负担日益加重。我国肺癌的发病率及死亡率已居所有恶性肿瘤之首，其中男性发病率和死亡率居第一位，女性的发病率居第二位，但其死亡率仍居第一位[1]。如何提高治疗肺癌的效果以及肺癌的存活率，一直以来都是医学界探讨和研究的问题，中医中药在治疗肿瘤方面成为了研究热点。青藤碱（Sinomenine，SIN）是防己科植物青风藤的根和茎中的有效成分，具有抗炎、抗免疫、镇咳、镇痛、镇静、降血压及治疗心律失常的作用[2]，它还有抑制细胞周期引起肿瘤细胞的凋亡[3]，具有抗肿瘤的作用，但是青藤碱对小细胞肺癌是否有抑制作用仍不清楚。本研究观察青藤碱对小细胞肺癌对NCI-H446的影响，并探讨其机制，为小细胞肺癌的治疗提供理论依据。

1.资料与方法

1.1 细胞株与试剂

人小细胞肺癌细胞株NCI-H446（武汉博士德生物工程有限公司）；青藤碱(安赛邦医药科技有限公司)；5-FUR(批号：20101112，江苏省南通市海尔斯药业)；F12K培养基（武汉博士德公司）；胎牛血清(FBS，美国Hyclone公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将NCI-H446细胞接种于含10%热灭活新生小牛血清、1%双抗（青霉素10KU/L和链霉素10mg/L）的F12K培养液中，置于37℃的细胞培养箱。细胞呈单层贴壁生长，实验和传代均取对数生长期细胞。

1.2.2 MTT实验取对数生长的小细胞肺癌细胞NCI-H446，用含10%胎牛血清及1%双抗（青霉素10KU/L和链霉素10mg/L）的F12K培养基调成1×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μL，在37℃、5%CO2条件下培养，待细胞贴壁后吸出培养基，加入100μL新鲜的基础培养液与100μL不同浓度的青藤碱溶液（浓度分别为50、100、150、200、250μg/ml），每组设5个复孔。分别培养12、24、36h后，每孔加入MMT20μ L(5mg/ml)。再用酶标仪于490nm处测定吸光度值，计算药物对NCI-H446的增殖抑制率，并计算半数抑制浓度（LC50）。细胞抑制率=（阴性对照组A490nm－实验组A490nm）/阴性对照组A490nm×100%，重复3次。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡 调整细胞浓度25cm2培养瓶中(coming)，每瓶106个细胞，培养箱中培养24h后，再于4℃培养2h，吸弃培养液并加入含青藤碱50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml 不同浓度的培养基2.5ml，作用12h、24h、36h后收集细胞，经固定后采用流式细胞仪检测细胞周期；Binding Buffer，Annex in v染色后检测细胞凋亡率和死亡率,每组实验重复3次。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 SIN对NCI-H446细胞增殖的抑制作用

SIN浓度＜100μg/ml对NCI-H446细胞的增殖无明显抑制。随着SIN浓度的升高和培养时间的延长，其对细胞增殖的抑制明显增强，有着显著的时间－剂量效应关系（图1）。SIN 250μg/ml培养36h，其抑制率最大为85.67%。

图1 青藤碱不同浓度对NCI-H446细胞增殖的抑制

2.2 SIN对NCI-H446细胞凋亡的影响

流式细胞Annexin V/PI检测细胞凋亡分析显示，不同浓度的SIN培养36h，随着SIN浓度的升高，早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例都在逐渐增加，与对照组相比其差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 流式细胞术检测细胞凋亡

3.讨论

近年来，我国肺癌的发病率呈逐年上升趋势，已经成为致死的主要恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。尤其小细胞肺癌，占肺癌的15%，其特征是倍增时间短，侵袭能力强，转移早而广泛，恶性程度高，预后差。大多数小细胞肺癌患者在诊断时已经是晚期，只能采取化疗结合放疗的治疗方案，治疗效果不理想，而且有着极大的副作用。因此，中医中药治疗肿瘤成为了临床上必要的选择。已有研究证明青藤碱对肝癌、乳腺癌、宫颈癌等具有抗增殖、抗肿瘤的作用[4-7]，但青藤碱对小细胞肺癌是否有抑制作用研究较少。本实验探讨青藤碱的抗肿瘤作用，以小细胞肺癌细胞为研究对象，对其作用的机制进行研究。本实验结果显示青藤碱有显著的促进人小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡，抑制细胞生长，而且随着SIN浓度的升高和培养时间的延长，呈现了浓度依赖性和时间依赖性。

综上，本实验研究认为青藤碱对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生长、增殖有明显的抑制作用并促进其凋亡，作为中药提取的有效成分，它具有较小的毒副作用及良好的抗肿瘤作用，在目前常规的放化疗基础上结合青藤碱中药辅助治疗，进一步提高小细胞肺癌的治疗效果，从而改善患者的预后，青藤碱具有较好的临床应用前景。