在线固相萃取-气相色谱/质谱法测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺

刘 欣， 梁梦洁， 张承明， 王 晋， 黄海涛， 陈建华，李雪梅， 孔维松， 杨叶昆， 许 永， 杨光宇， 李 晶*

(1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明 650106；2.昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明 650500)

烟草特有亚硝胺(Tobacco Specific N-nitrosamines，TSNAs)是由烟草内源性生物碱与硝酸盐及亚硝酸盐通过亚硝化作用产生的一类具有致癌性化合物，它是卷烟烟气中可能诱发癌症的主要活性成分之一。目前研究较多的4种TSNAs主要是：N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)[1 - 2]。其中，国际癌症组织(IRAC)已将NNK与NNN列为I类人体致癌物[2]，我国烟草行业也将NNK列为7种主要有害成分之一[3]。由于TSNAs在卷烟烟气中的释放量水平一般在纳克/支，而烟气基质又十分复杂，想要对卷烟主流烟气中的TSNAs含量进行准确定量分析较为困难。因此，准确、快速的测定卷烟烟气中TSNAs的含量对提高卷烟产品的吸食安全性以及吸烟对健康的危害研究均具有重要的现实意义。

目前，关于TSNAs的检测方法主要有气相色谱-热能分析仪法(GC-TEA)[4 - 5]、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)[6 - 8]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用法[9 - 11]等。其中，由于TEA是专一性的检测器，对TSNAs具有较好的选择性，因此GC-TEA法应用最为广泛，但是该方法灵敏度较低，分析时间过长；LC-MS/MS法的灵敏度和选择性均高于GC-TEA法，但其仪器维护成本高，且噪音偏高；而GC/MS法由于其卓越的色谱分离能力，已逐渐成为测定卷烟主流烟气中TSNAs的常用方法，但由于烟气样品基质复杂，在测定TSNAs前需要进行柱层析或固相萃取净化操作，样品前处理过程十分繁杂费时。针对上述方法在测定TSNAs中存在的不足，本研究建立了一种简单、快速的测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的GC/MS法，具体是在凝胶净化-气相色谱联用仪中将碱性氧化铝固相萃取柱替代凝胶净化柱，通过大体积进样将样品富集在固相萃取柱上，再用洗脱液进行反向洗脱，此时就可以将富集的TSNAs洗脱下来，待排干溶剂后再进行气相色谱/质谱分析。在本文改进的方法中，样品的固相萃取净化可在线完成，萃取溶液可直接进样分析，前处理过程十分简单、方便，且进样体积大幅度增加，检测灵敏度相比常规方法大幅提高。该方法旨在为分析卷烟烟气中TSNAs的含量提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

QP 2010 Plus在线GPC(LC-20AD)-GC/MS联用仪(日本，Shimadzu公司)；SM450直线型吸烟机(英国，CERULEAN公司)；YQ-1001C型超声波清洗机(上海易净超声波清洗设备厂)；AE240电子分析天平(感量0.1 mg，瑞士Mettler公司)；球形氧化铝(10 mm×2.0 mm，3～5 μm，德国Mecker公司)，通过匀浆法装填制成在线固相萃取柱。

标准品：NNK、NNN、NAT、NAB(纯度均≥98%，加拿大TRC公司)；内标物：NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4(纯度均≥99%，加拿大TRC公司)；二氯甲烷、甲醇(均为色谱纯，美国Fisher公司)。

1.2 实验方法

图1 在线固相萃取-气相色谱/质谱检测系统结构示意图Fig.1 Schematic diagram of on-line SPE and GC/MS system

1.2.1 在线固相萃取-气相色谱/质谱法检测系统在线固相萃取-气相色谱/质谱检测系统结构示意图如图1所示：整个系统主要由阀A、阀B、固相萃取柱、泵A、泵B和GC-MS分析系统组成，泵A主要负责输送流动相A，泵B主要负责输送流动相B，固相萃取柱为碱性氧化铝在线固相萃取柱(10 mm×2.0 mm，3～5 μm，理论萃取容量为5 mg)；流动相A：二氯甲烷；流速：0.2 mL/min；流动相B：二氯甲烷-甲醇(92∶8)；流速：0.2 mL/min。

阀切换及操作过程：(1)样品富集及净化：色谱进样后(进样量200 mL)，流动相A通过泵A推动样品进入固相萃取柱进行富集，由阀A的1口进入，2口流出，2口与4口之间连接有固相萃取柱，流向为：1→2→4，经阀A的3口进入阀B的3口，最后从阀B的5口排入废液。(2)样品洗脱：切换阀A，流动相B通过泵B反向洗脱固相萃取柱，并进行溶剂切割，具体由阀A的5口进入，4口流出，流向为：5→4→2，经阀A的3口进入阀B的3口，前0.3 min(死体积)的流出液均通过阀B的5口排入废液，通过阀B控制切割随后0.6 min(切割体积120 μL)的洗脱液进入气相色谱/质谱进行分析。(3)GC/MS分析：气相色谱中配置有体积为200 μL的惰性石英管，由液相色谱切割过来的馏分进入到惰性石英管中，经真空蒸发排出溶剂后，再升温气化，由载气输送先后进入预柱和分析柱，经色谱分离后再进入质谱进行检测分析。(4)固相萃取柱清洗：在气相色谱/质谱分析过程中，前期净化系统可同步完成固相萃取柱的清洗与平衡操作(流动相B通过泵B反向洗脱固相萃取柱，切换阀A平衡固相色谱柱)，清洗时间：流动相B冲洗10 min；平衡时间：流动相A冲洗2 min以上。

1.2.2 溶液的配制标准储备溶液的配制：准确称取0.1 g标准品NNN，NNK，NAT，NAB(精确至0.1 mg)，用二氯甲烷溶解并定容，配制成浓度为1.0 mg/mL的混合标准储备溶液，密封贮存于—20 ℃冰箱。内标储备溶液的配制：准确称取0.1 g的内标物NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4(精确至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，加入二氯甲烷，待完全溶解后定容，得到1.0 mg/mL的混合内标储备溶液，密封贮存于—20 ℃冰箱。后续实验以二氯甲烷逐级稀释混合标准储备溶液，得到0.10～15 ng/mL的系列标准工作溶液，其中，标准工作溶液中内标物的浓度均为1.0 ng/mL。以二氯甲烷为溶剂，稀释混合内标储备溶液浓度至1.0 ng/mL，作为样品萃取溶液。

1.2.3 样品前处理及分析按照国家标准(GB/T 16447-2004)[12]规定的方法平衡卷烟样品48 h，然后利用SM450型直线型吸烟机抽吸5支卷烟样品，并根据国家标准(GB/T 19609-2004)[13]中规定方法捕集烟气，将捕集了主流烟气总粒相物的剑桥滤片转移至50 mL的锥形瓶中，加入20 mL样品萃取液，超声萃取40 min后，取上清萃取液过0.22 μm有机相滤头后进样分析。

1.2.4 仪器分析条件参照文献报道[6]，对色谱及质谱条件进行设置。气相色谱系统的预柱为DB-5 MS柱(5 m×0.25 mm×0.25 mm)；分析柱为HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；载气为氦气(纯度≥99.999%)；流量为1.2 mL/min；进样口温度250 ℃；色谱柱升温程序：初始温度150 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升至190 ℃，再以2 ℃/min速率升至250 ℃，保持20 min。

质谱条件：电离方式为EI源；电离能量30 eV；离子源温度250 ℃；四极杆温度120 ℃；扫描模式为选择离子监测(SIM)模式；NNK、NNN、NAT、NAB的定量离子分别为m/z177、177、159、161；其4种同位素内标的定量离子分别为m/z181、181、163、165。

2 结果与讨论

2.1 样品萃取前处理条件的选择

二氯甲烷常用于剑桥滤片中TSNAs的萃取[4,6]，本文不再做萃取溶液的优化选择。利用1.2.3项下的前处理方法收集5支卷烟主流烟气的总粒相物，利用20 mL二氯甲烷(含内标)进行超声萃取。实验结果表明当萃取时间达35 min后，TSNAs的萃取效果已不发生变化，考虑到不同类别卷烟样品的萃取效果，特优选40 min作为样品萃取时间。

2.2 固相萃取柱的选择

将碱性氧化铝在线固相萃取柱应用于凝胶净化-气相色谱联用仪中(替代凝胶净化柱)，相较于凝胶净化，提取液可以大体积进样，且待目标物富集后，还可以通过固相萃取柱的反接，集中洗脱TSNAs，避免前期前处理造成目标物峰展宽及分散，影响色谱分析；同时，实验还对固相萃取柱的柱容量进行了考察：实验中装填的固相萃取柱规格为10×2.0 mm，3～5 μm，理论萃取容量为5.0 mg，远远高于样品中的TSNAs含量(ng级别)，可以满足大体积进样的要求。

2.3 洗脱溶剂的选择

通过文献调研[4,6]和实际分析发现，利用二氯甲烷作为洗脱溶剂时，样品中的TSNAs能较好的保留在碱性氧化铝固相萃取柱上，达到一定的净化效果，且样品萃取液也为二氯甲烷可以保证前处理系统溶剂的一致性。清洗固相萃取柱：待样品萃取液进样完成富集后，利用1 mL二氯甲烷进行固相萃取柱的清洗净化，通过实验发现，样品完全过完柱子需1.5 min，其中样品200 μL，包括死体积100 μL，待过完柱后，用流动相A继续洗涤5.0 min，部分小极性杂质被洗出；洗脱固相萃取柱：选择二氯甲烷-甲醇(92∶8)为洗脱溶剂进行优化实验，前0.3 min(死体积)的流出液均排入废液，通过阀B切割随后洗脱溶剂进入气相色谱系统，结果发现：当洗脱溶剂的体积达80 μL时，TSNAs回收率可达96.8%，继续增加洗脱溶剂的体积对回收率没有明显的影响。为了保证方法的稳定性和重复性，实验对洗脱溶剂的体积进行了调整，选取切割120 mL的二氯甲烷-甲醇(92∶8)进入气相色谱；在切割了富集部分后，继续使用洗脱溶剂对固相萃取柱进行清洗(10 min)，以保证固相萃取柱的清洁和可重复性。当下一个样品开始分析前，采用二氯甲烷平衡固相萃取柱2 min以上，即可进行进样操作。

2.4 进样量的选择

考察了液相色谱进样体积对分析结果和色谱峰宽的影响，在50～500 μL范围内，随着进样体积的增加，气相色谱的色谱峰略有扩宽，但不影响待测成分的完全分离，并且不同进样体积下各待测成分的回收率均在95%以上，具有很高的回收率。在实际样品分析中，进样体积为200 μL时已完全能满足样品分析的灵敏度要求。因此，本方法选择200 μL作为液相色谱进样量。

通过对样品萃取时间、固相萃取柱、洗脱溶剂与进样量的选择和优化，在选定条件下，4种TSNAs实际样品的色谱图见图2。

图2 4种烟草特有亚硝胺选择离子色谱图Fig.2 The SIM chromatogram of four TSNAs

2.5 工作曲线、检测限和定量限

在优化确定的色谱条件下，分析前述系列标准溶液，使用保留时间与组分特征离子定性，内标法定量。以标准溶液中4种TSNAs定量离子(见1.2.4项下)的峰面积与内标定量离子峰面积之比y作为纵坐标，待测成分浓度与内标浓度之比x为横坐标绘制标准曲线，结果见表1。从表1结果可知，4种待测目标物在0.15～10 ng/mL的线性浓度范围内，线性相关系数>0.999，表明本方法的线性关系较好；采用3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)计算得到本方法的检测限为0.03～0.04 ng/g，定量限为0.10～0.14 ng/g，方法灵敏度高。

表1 方法工作曲线、相关系数、检测限及定量限

2.6 方法回收率和精密度

取已知目标物含量的相同样品4份，按照10、20、40 ng 3个添加水平加标在剑桥滤片上，分别进行加标回收率实验的考察，按照1.2.3项下前处理方法和1.2.4项下仪器条件进行分析，计算样品加标回收率和相对标准偏差(RSD)。结果显示：在3个不同添加水平下，4种TSNAs的回收率在92.4%～97.5%之间，回收率结果较为理想；日内RSD(n=7)在2.4%～3.0%之间，日间RSD(n=7)在2.8%～3.3%之间，方法稳定。

2.7 与现有方法的对比

分别采用本方法与CORESTA N°63方法测定了8个烤烟型卷烟样品主流烟气中TSNAs的含量，并通过配对t检验法对上述两种检测方法的测定结果进行了分析，结果表明，两种方法的测定结果没有显著性差异(p>0.05)。

3 结论

针对复杂烟气中TSNAs含量较低的检测难题，本研究建立了测定烟气中4种TSNAs的在线固相萃取-气相色谱/质谱检测方法。方法选用新型球形氧化铝装填的固相萃取柱进行杂质净化，结合在线固相萃取模式，前处理操作简单、净化效率高且可在线完成。4种TSNAs的加标回收率在92.4%～97.5%之间，日内与日间精密度均低于3.5%，检测限在0.03～0.04 ng/g之间，定量限在0.10～0.14 ng/g之间。本方法的灵敏度高、重复性好，可用于卷烟主流烟气中TSNAs的高通量检测分析。