无标准品时芬太尼类物质及其前体的快速筛查

2019-11-06张伟亚林君峰王成云

分析科学学报 2019年5期

张伟亚，林君峰，闫杰，王成云*

(1.深圳海关工业品检测技术中心，广东深圳 518067；2.深圳市检验检疫科学研究院，广东深圳 518010)

自2000年以来，全球范围内报告滥用新型精神活性物质(Novel Psychoactive Substances,NPS)的情况急剧增加。在2009～2017年期间，有102个国家向联合国毒品和犯罪办公室报告了803种NPS。NPS是没有被联合国国际公约管制，但存在滥用，并会对公众健康造成危害的单一物质或者混合物质，它是对管制毒品进行化学结构修饰得到的毒品类似物，但具有与管制毒品相似或更强的效果，现已成为继传统毒品、合成毒品后全球流行的第三代毒品，一般包括合成大麻素、兴奋剂(苯乙胺、卡西酮、哌嗪等)、致幻剂或分离型致幻剂(氯胺酮及苯环利定)、镇定剂、色胺、氨基茚及芬太尼类合成阿片等[1]。芬太尼自产生以来，主要是用于临床麻醉使用。由于其具有非常优良的作用，以其为母体合成了上百种芬太尼类似物质。芬太尼的合成一般是通过前体N-苯乙基-4-哌啶酮(NPP)与苯胺脱水缩合得亚胺衍生物，然后被还原为4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)。至2018年底，此两种前体和25种芬太尼类物质被我国列入管制。芬太尼类物质是强麻醉剂[2]，其最严重的不良反应是抑制呼吸，导致呼吸暂停。

芬太尼类物质可采用气相色谱/质谱(GC-MS)联用法[3 - 8]、液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)[9 - 12]、液相色谱/串联质谱法(HPLC-MS/MS)[13 - 20]、液相色谱/高分辨质谱法(HPLC-HRMS)[21 - 25]等进行精确定性和定量，还可采用表面增强拉曼光谱法[26 - 28]等方法进行快速筛查。由于芬太尼类物质属于管制类物质，难以获得标准品或对照品，故现有文献涉及的芬太尼种类都不多，主要集中在芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼、卡芬太尼、奥芬太尼等，其他的芬太尼类物质鲜见报道。Strayer等人[29]采用LC-MS/MS法测定血液中芬太尼的含量，共检测24种芬太尼及其类似物，是目前公开报道的文献中涉及芬太尼类物质种类最多的，但也只涉及了我国列管的17种、联合国列管的14种芬太尼类物质。目前尚未见文献报道对联合国管制的27种芬太尼类物质及其前体进行测定。

芬太尼类物质种类繁多，可能出现的新品种数量无法估量，列入管制的品种也不断增多。2019年3月，联合国毒品与犯罪办公室宣布将甲氧基芬太尼、环丙基芬太尼、邻氟芬太尼和对氟丁酰芬太尼列入管制目录，使受管制的总数量达到25种芬太尼类物质和2种前体。从2019年5月1日开始，我国对芬太尼类物质实行整类列管。鉴于难以获得全部受管制的芬太尼类物质及其前体标准品，因此，开发一个不需要标准品的筛查方法就十分必要。魏万里等人[30]利用高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-TOF-MS)开发了甲卡西酮的无标准品定性定量检验方法，表明了此类方法的实际可行性。静电场轨道阱高分辨质谱(Orbitrap HRMS)采用准分子离子精确质量数进行定性，采用二级离子碎片进行确证。根据物质的分子结构和分子式，可以确定其准分子离子精确质量数，并推导出可能的二级离子碎片，不需要使用标准品就可以完成定性和确证。本文采用超高效液相色谱/静电场轨道阱(UPLC/Orbitrap HRMS)技术建立了32种受管制的芬太尼类物质及其前体的快速筛查方法(检测对象涵盖了联合国列管的全部25种芬太尼类物质和2种前体)。芬太尼类物质及其前体具体信息列行表1。

表1 32种芬太尼类物质及其前体信息

(续表1)

No.NameIUPAC NameFormulaCAS No.23#Acryl fentanylN-Phenyl-N-[1-(2-phenylethyl)-4-piperidinyl]acrylamideC22H26N2O82003-75-624#Valeryl fentanylN-Phenyl-N-[1-(2-phenylethyl)-4-piperidinyl]pentanamideC24H32N2O122882-90-025#Tetrahydrofuranyl fentanylN-(1-phenethylpiperidin-4-yl)-N-phenyltetrahydrofuran-2-carboxamideC24H30N2O22142571-01-326#NPPN-phenethyl-4-piperidoneC13H17NO39742-60-427#4-ANPPN-Phenyl-1-(2-phenylethyl)piperidin-4-amineC19H24N221409-26-728#Methoxyacetyl fentanyl2-Methoxy-N-phenyl-N-[1-(2-phenylethyl)-4-piperidinyl]acetamideC22H28N2O2101345-67-929#Cyclopropyl fentanylN-(1-Phenethylpiperidin-4-yl)-N-phenylcyclopropanecarboxamideC23H28N2O1169-68-230#2-FluorofentanylN-(2-Fluorophenyl)-N-[1-(2-phenylethyl)-4-piperidinyl]propanamideC22H27FN2O-31#Cyclobutyl fentanylN-(1-Phenethylpiperidin-4-yl)-N-phenylcyclobutanecarboxamideC24H30N2O-32#Cyclohexyl fentanylN-(1-Phenethylpiperidin-4-yl)-N-phenylcyclohexanecarboxamideC26H34N2O -

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000-Q Exactive超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国，Thermo Scietific公司)，配电喷雾正离子源(ESI+)。

色谱纯甲酸(纯度98.0%)、甲酸铵(纯度97.0%)(德国CNW Technologies公司)；实验用水为经Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)处理的高纯水。

1.2 样品前处理

准确称取样品10 mg，用10 mL乙腈溶解，稀释至合适浓度后，进样分析。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱分析条件Accucore Phenylhexyl色谱柱(100×2.1 mm×2.6 μm，Thermo Scietific公司)；流动相A为0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L甲酸铵)，流动相B为49.5%甲醇/49.5%乙腈/1.0%水(含0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸铵)。梯度程序：0.0～9.9 min，99%A；10.0 min时，流动相线性递变为1%A，维持至11.5 min；11.6 min时，流动相变为99%A，维持至15.5 min。流速0.5 mL/min，进样量1.0 μL，进样室温度7 ℃，色谱柱温度40 ℃。

1.3.2 质谱分析条件可加热电喷雾离子源，正离子(ESI+)模式，喷雾电压3 200 V，毛细管温度320 ℃，辅助气温度400 ℃，鞘气流速30 mL/min，辅助气流速10 mL/min，扫描方式为Full MS/ddMS2，Full MS分辨率为35 000，ddMS2分辨率为17 500，扫描范围为m/z70～m/z1 000。根据准分子离子精确质量数进行定性，利用二级质谱碎片进行确证。

2 结果与讨论

2.1 筛查列表的建立

在ESI+模式下，芬太尼类物质及其前体的一级质谱均只有1个峰，即其准分子离子[M+H]+。它在一定电压下断裂，产生二级子离子。以芬太尼为例说明其断裂机理[31]，芬太尼准分子离子[M+H]+中N-苯基酰胺部分的C-N键发生α-断裂，脱去1个丙醛基团，生成离子A，哌啶环中N-C键和C-C键发生断裂，生成离子F、G，离子A还可进一步发生断裂，生成离子B、C；[M+H]+还可断裂生成离子D，其哌啶环与N-苯基酰胺取代基还可发生断裂，生成离子E。图1给出了芬太尼可能的断裂途径。其它芬太尼类物质的断裂机理与芬太尼类似。前体4-ANPP的断裂机理与芬太尼类似，但不出现离子A。前体NPP根据同样的断裂机理生成离子B、D、F；其哌啶环上发生断裂，失去一个羰基基团后发生环闭合，生成离子E，其化学式为C12H18N，精确质量数为m/z176.14338，而芬太尼的离子E化学式则为C13H18N，精确质量数为(m/z188.14338；此外，离子A、C、G不出现。32种目标分析物的准分子离子和二级碎片离子信息见表2(表2中各目标分析物的序号同表1)。

图1 ESI+模式下芬太尼可能的断裂途径Fig.1 Proposed fragmentation pathways of product ion for fentanyl in ESI+ mode

No.[M+H]+Segment ASegment BSegment CSegment DSegment ESegment FSegment G1#FormulaC22H29N2OC20H27N2C11H14NC9H10NC9H11C14H20NC10H14NC13H16NOAccurate mass337.22744295.21168160.11208132.08078119.08553202.15903148.11208202.122642#FormulaC22H29N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC14H18NOAccurate mass337.22744281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643216.138293#FormulaC21H33N6O3C18H29N6O2C7H12N5OC11H14NOC5H9N4OC12H22N5O2C6H12N5OC16H22NO2Accurate mass417.26087361.23465182.10364176.10699141.07709268.17680170.10364260.164514#FormulaC23H31N2OC20H27N2C11H14NC9H10NC9H11C14H20NC10H14NC14H18NOAccurate mass351.24309295.21688160.11208132.08078119.08553202.15903148.11208216.138295#FormulaC23H31N2OC20H27N2C10H12NC9H10NC8H9C14H20NC9H12NC15H20NOAccurate mass351.24309295.21168146.09643132.08078105.06988202.15903134.09643230.153946#FormulaC23H31N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC15H20NOAccurate mass351.24309281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643230.153947#FormulaC23H31N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC15H20NOAccurate mass351.24309281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643230.153948#FormulaC21H29N2OSC18H25N2SC9H12NSC9H10NC7H9SC12H18NSC8H12NSC14H18NOAccurate mass357.19951301.17330166.06850132.08078125.04195208.11545154.06850216.138299#FormulaC21H29N2OSC18H25N2SC8H10NSC9H10NC6H7SC12H18NSC7H10NSC15H20NOAccurate mass357.19951301.17330152.05285132.08078111.02630208.11545140.05285230.1539410#FormulaC22H29N2O2C19H25N2OC10H12NOC9H10NC8H9OC13H18NOC9H12NOC14H18NOAccurate mass353.22235297.19614162.09134132.08078121.06479204.13829150.09134216.1382911#FormulaC23H31N2O2C20H27N2OC10H12NOC9H10NC8H9OC14H20NOC9H12NOC15H20NOAccurate mass367.23800311.21179162.09134132.08078121.06479218.15394150.09134230.1539412#FormulaC22H28N2OFC19H24N2FC10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC14H17NOFAccurate mass355.21802299.19180146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643234.1288713#FormulaC20H29N2O5C17H25N2O4C6H10NO2C11H12NO2C4H7O2C11H18NO4C5H10NO2C16H20NO3Accurate mass377.20710321.18088128.07061190.0862687.04406228.12303116.07061274.1437714#FormulaC22H31N2O2SC19H27N2OSC8H10NSC11H14NOC6H7SC13H20NSOC7H10NSC16H22NO2Accurate mass387.21008331.18386152.05285176.10699111.02630238.12601140.05285260.1645115#FormulaC20H27N2OSC17H23N2SC8H10NSC9H10NC6H7SC11H16NSC7H10NSC14H18NO

(续表2)

No.[M+H]+Segment ASegment BSegment CSegment DSegment ESegment FSegment GAccurate mass343.18386287.15765152.05285132.08078111.02630194.09980140.05285216.1382916#FormulaC21H27N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC13H16NOAccurate mass323.21179281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643202.1226417#FormulaC20H27N2O2SC17H23N2SOC8H10NSOC9H10NOC6H7SOC11H16NSOC7H10NSOC14H18NOAccurate mass359.17878303.15256182.05084148.07569127.02121210.09471156.04776216.1382918#FormulaC23H30N2OFC19H24N2FC10H12NC9H9NFC8H9C13H18NC9H12NC15H19NOFAccurate mass369.23367299.19180146.09643150.07135105.06988188.14338134.09643248.1445219#FormulaC23H30N2OFC19H24N2FC10H12NC9H9NFC8H9C13H18NC9H12NC15H19NOFAccurate mass369.23367299.19180146.09643150.07135105.06988188.14338134.09643248.1445220#FormulaC22H28N2O2FC19H24N2FC10H12NC9H9NFC8H9C13H18NC9H12NC14H17NO2FAccurate mass371.21293299.19180146.09643150.07135105.06988188.14338134.09643250.1237821#FormulaC24H31N2O3C21H27N2O2C10H12NC11H12NO2C8H9C15H20NO2C9H12NC16H20NO3Accurate mass395.23292339.20670146.09643190.08626105.06988246.14886134.09643274.1437722#FormulaC24H27N2O2C19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC16H16NO2Accurate mass375.20670281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643254.1175623#FormulaC22H27N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC14H16NOAccurate mass335.21179281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643214.1226424#FormulaC24H33N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC16H22NOAccurate mass365.25874281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643244.1695925#FormulaC24H31N2O2C19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC16H20NO2Accurate mass379.23800281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643258.1488626#FormulaC13H18NO-C10H12N-C8H9C12H18NC9H12N-Accurate mass204.13829-146.09643-105.06988176.14338134.09643-27#FormulaC19H25N2-C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC11H14NAccurate mass281.20123-146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643160.1120828#FormulaC22H29N2O2C19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC14H18NO2Accurate mass353.22235281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643232.1332029#FormulaC23H29N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC15H18NOAccurate mass349.22744281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643228.1382930#FormulaC22H28N2OFC19H24N2FC10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC14H17NOFAccurate mass355.21802299.19180146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643234.1288731#FormulaC24H31N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC16H20NOAccurate mass363.24309281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643242.1539432#FormulaC26H35N2OC19H25N2C10H12NC9H10NC8H9C13H18NC9H12NC18H24NOAccurate mass391.27439281.20123146.09643132.08078105.06988188.14338134.09643270.18524

-：the ion fragment did not appear.

根据表2提供的准分子离子和二级碎片离子的精确质量数和分子结构，建立1个数据库，利用TraceFinder软件建立筛查列表，根据准分子离子精确质量数进行快速筛查，利用二级碎片离子精确质量数及分子结构进行确证，精确质量数偏差要求小于5×10-6。根据欧盟指令2002/657/EC的要求，利用二级质谱确证时要求至少4.0个识别点，而高分辨质谱一级、二级子离子分别能提供2.0、2.5个识别点。为确保确证结果的可靠性，对每个目标分析物，均提供了3个以上的二级子离子碎片，此时识别点不小于9.5，远远超过了2002/657/EC的要求。

2.2 实际样品的快速筛查和确证

对某海关协助提供的9个白色粉末样品进行快速筛查，结果在1#、2#样品中同时检出芬太尼和前体4-ANPP，3#～9#样品中同时检出4-ANPP、芬太尼和乙酰芬太尼。图2(a)、图2(b)分别是1#、3#样品的UPLC/Orbitrap HRMS提取离子色谱图。图2(a)中出现在5.20 min、5.42 min处的谱峰分别是4-ANPP和芬太尼，图2(b)中出现在4.93 min、5.20 min、5.42 min处的谱峰分别是乙酰芬太尼、4-ANPP和芬太尼。

图2 实际样品的提取离子图Fig.2 Extracted ion chromatograms of real samplesa.1# sample,b.3# sample.1:4-ANPP；2：fentanyl；3：acetyl fentanyl.

在ESI+模式下，4-ANPP、芬太尼、乙酰芬太尼的准分子离子[M+H]+化学式分别为C19H25N2、C22H29N2O、C21H27N2O，发生断裂后可能生成的二级碎片离子信息见表2。在实际工作中，部分碎片可能会消失。对图2(b)(3#样品)中检出的4-ANPP、芬太尼、乙酰芬太尼等3个组分进行二级质谱分析，结果见图3。4-ANPP本身没有二级碎片离子A，除4-ANPP的二级碎片离子中碎片离子G和乙酰芬太尼的二级碎片离子中碎片离子A未出现外，其余碎片离子均被检出。作为对比，对标准品4-ANPP、芬太尼和乙酰芬太尼进行了测试。结果表明，样品中被检出组分与标准品的准分子离子及二级碎片离子的精确质量数偏差均在欧盟法规SANCO/12571/2013规定的范围内。表3列出了3#样品中检出的4-ANPP、芬太尼、乙酰芬太尼以及标准品4-ANPP、芬太尼、乙酰芬太尼的二级碎片离子的精确质量数测定值及与其理论值的偏差，偏差范围为-4.13×10-6～+3.51×10-6，均小于±5×10-6，满足欧盟法规SANCO/12571/2013对高分辨质谱定性鉴定的要求。欧盟指令2002/657/EC规定，采用二级质谱离子碎片进行确证时，至少需要达到4.0个识别点。本方法中利用1个一级母离子和5～7个二级离子进行确证，识别点高达14.5～19.5，根据图3，确证该样品中检出4-ANPP、芬太尼、乙酰芬太尼。

图3 1个阳性样品中3个组分及标准品的二级离子碎片图Fig.3 Secondary ion fragments of standards and three target compounds in a positive sample(a):4-ANPP；(b)：fentanyl；(c)：acetyl fentanyl；(d):4-ANPP standard;(e)：fentanyl standard; (f) acetyl fentanyl standard.

根据刑法相关规定，对于新型毒品要做含量鉴定。利用购自Alta Scientific Co.Ltd.的标样芬太尼(纯度98.5%)、4-ANPP(纯度97.0%)、乙酰芬太尼(纯度97.4%)来确定9个实际样品中检出的4-ANPP、芬太尼和乙酰芬太尼的纯度，结果见表4。1#、2#样品中同时检出前体4-ANPP和少量芬太尼，这可能是在运输、分装样品的过程中被污染而造成的。3#～9#样品中芬太尼的纯度分别为85.25%、74.93%、86.42%、79.38%、66.18%、69.84%、59.58%，这7个样品中同时还检出微量的乙酰芬太尼和前体4-ANPP。

表3 阳性样品中检出的3种芬太尼类物质及其前体与其标准品的准分子离子及二级离子碎片(m/z)

-:the ion fragment did not appear.

表4 实际样品测试结果(%)

-:no detected.

3 结论

芬太尼类物质及其前体是受到严格管制的新的精神活性物质，其种类繁多，且不断出现新的品种，但难以获得所有的标准品或对照品，因而建立1个能同时检测所有受管制芬太尼类物质及其前体的分析方法十分困难。本文基于Orbitrap技术建立了1个不使用标准品的分析方法，实现了对包括联合国列管的全部27种芬太尼类物质及其前体在内的32种受管制的芬太尼类物质和前体的快速筛查和确证。该方法简便快速，灵敏度高，定性准确，可适用于无标准品时对芬太尼类新精神活性物质的快速筛查和确证。