超高效液相色谱-飞行时间质谱测定牛奶中9种真菌毒素

李 玮*, 艾连峰, 马育松, 陈瑞春, 郭春海

(石家庄海关，河北石家庄 050051)

真菌毒素是真菌在粮食和饲料中生长所产生的代谢产物，这些毒素通过食物链从奶牛体内转移至牛奶中，受污染的牛奶经过巴氏杀菌后，真菌毒素几乎不被破坏，长期摄入后会引起人类和动物的急性或慢性中毒，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等，部分真菌毒素已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用[1]。

目前，关于食品尤其是谷物、坚果等农产品和饲料中真菌毒素检测的报道较多[2 - 5]，主要有酶联免疫法(ELISA)[6]、薄层色谱法(TLC)[7]、高效液相色谱法(HPLC)[8]和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[9 - 10]。本文建立了基于超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-TOF MS)的快速、高通量分析牛奶中9种真菌毒素的方法，为牛奶样品的高通量快速检测提供了可靠的分析平台。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-30A超高效液相色谱仪(日本，岛津公司)；AB SCIEX TripleTOF5600+高分辨质谱仪(美国，AB SCIEX公司)；HITACHI离心机(日本，日立公司)；VORTEX-2 GENE涡旋混合器(美国，Scientific公司)；超声波清洗器(中国)；Turbo Vap型氮气吹干仪(美国，Zymark公司)。

标准品：黄曲霉毒素B1(AF B1)、黄曲霉毒素B2(AF B2)、黄曲霉毒素G1(AF G1)、黄曲霉毒素G2(AF G2)、黄曲霉毒素M1(AF M1)、黄曲霉毒素M2(AF M2)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)均购于美国SUPELCO公司，用甲醇稀释至所需质量浓度，4 ℃保存；用空白基质溶液稀释标准溶液成一系列混合基质标准工作溶液，现用现配。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸(色谱纯，Fluka)；无水Na2SO4(分析纯)；无水MgSO4(分析纯)；C18(分析纯)。实验用水均为Milli-Q(美国Millipore公司)高纯水。

1.2 样品预处理

准确称取5.00 g牛奶样品于50 mL具塞离心管中，加入6 g无水Na2SO4和25 mL 1%乙酸乙腈，振摇1 min，超声提取10 min，5 000 r/min离心6 min，移取上清液6 mL至另一带螺旋盖的10 mL离心管中，待净化。将QuEChERS净化粉(800 mg无水MgSO4、100 mg C18)加入装有6 mL提取液的离心管，涡旋混匀1 min，5 000 r/min离心6 min。准确移取5.0 mL上清液至氮吹管中，于40 ℃氮气吹干，加1.0 mL 0.1%乙酸-乙腈(9+1)复溶，涡旋混合后，过0.22 μm滤膜，待测。

1.3 色谱及质谱条件

色谱条件：Agilent proroshell 120 EC-C18柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸-10%甲醇，B为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸-90%甲醇；梯度洗脱程序：0～3 min B从5%升到30%，3～7 min B升到90%，7～9 min保持B为90%，9～9.10 min B从90%降至5%，9.10～11 min保持B为5%；流速：0.4 mL/min，柱温：40 ℃，进样体积：20 μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子或负离子扫描模式；离子源电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；一级质谱扫描范围m/z100～1 000；二级质谱扫描范围80～800；质谱调谐：正(负)离子模式自动调谐。其他信息见表1。

表1 9种真菌毒素的信息

图1 不同溶剂对9种真菌毒素的提取效果Fig.1 Extraction efficiency of the different solvent for 9 mycotoxins

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

真菌毒素大多较易溶于甲醇、乙腈、水等极性溶剂中，但乙腈使样品中蛋白质变性沉淀的效果比甲醇好，因此实验比较了乙腈、1%乙酸乙腈、乙腈-水(84+16)和乙腈-1%乙酸水(84+16)4种提取溶剂对牛奶中9种真菌毒素的提取效果(图1)。结果表明1%乙酸乙腈对9种目标物的提取效率较好，因此选择1%乙酸乙腈为提取溶剂。

2.2 净化方式的选择

QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Rugged,Safe)提取方法最早主要用于农药残留检测，由于其具有简便、快速等优点，近年来被广泛用于各种检测领域，其中也包括真菌毒素的检测[11 - 12]。在QuEChERS提取方法中，通常加入无水MgSO4产生盐析效应，降低提取液中水分含量，方便后续的浓缩步骤；除此之外还会加入C18和乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA)来吸附脂肪、糖及有机酸。实验考察了500～1 000 mg无水MgSO4、30～150 mg C18及0～100 mg PSA按不同比例组合的净化效果。结果表明，PSA对实验没有影响，采用800 mg无水MgSO4和100 mg C18为组合净化剂进行分散固相萃取时，样品溶液澄清，基质干扰较小，回收率最佳。

2.3 质谱条件选择

在TOF MS模式下对目标化合物同时进行一级、二级质谱全扫描，一级质谱扫描范围m/z100～1 000，二级质谱扫描范围m/z80～800。利用MasterView软件对目标物进行分析，通过每个化合物的分子式得到理论质量数和实测质量数，处理后得到每个化合物的二级全扫描图，选择响应最高的两个碎片离子作为子离子。将实测质量数作为母离子，建立质谱条件：先在m/z100～1 000范围内全扫描，然后设定每个化合物的实测质量数并设定在m/z80～800范围内进行二级全扫描。利用二级质谱定量，同时通过库检索，以目标化合物的一级、二级质谱、精确分子量、保留时间、同位素丰度匹配、特征离子等信息进行定性确认分析。9种目标物的提取离子色谱图见图2。

图2 牛奶中9种目标物的定量限添加水平提取离子色谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms of 9 compounds in milk of LOQ level

2.4 回收率及精密度

通过在空白牛奶样品中分别添加3个不同水平的待测目标物，平行测定5次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表2。以信噪比(S/N)=10确定样品检测的定量限，9种真菌毒素的定量限为1～20 μg/kg。

表2 方法的灵敏度、线性关系及回收率(n=5)

2.5 实际样品测定

在市场上购买不同品牌牛奶样品20份，按照上述方法进行测试，结果1份样品中检出AFM1含量为1.2 μg/kg。

3 结论

本研究应用超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱建立了牛奶中9种真菌毒素的分析方法，实现了牛奶中9种真菌毒素的定量及定性确证分析。该方法具有适用性强、简单快速等特点，为食品安全领域提供重要的技术支持。