pH值对HPLC-ICP-MS测定水体中不同形态砷化合物的影响

董会军， 董建芳， 王昕洲， 李义， 赵峰

(河北省地质环境监测院， 河北省地质资源环境监测与保护重点实验室， 河北 石家庄 050021)

砷元素的形态分析被广泛关注，主要是由于其毒性很大程度上取决于其存在形态[1]。目前环境中已知的不同形态的砷化合物超过了30种，尤其海产品中不同形态的砷化合物更为丰富[2-3]。最常见的几种砷形态为三价砷[As(Ⅲ)]、五价砷[As(Ⅴ)]、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)，有些海产品中还含有砷甜菜碱(AsB)和砷胆碱(AsC)，一般认为无机砷的毒性大于有机砷，而砷甜菜碱和砷胆碱常被认为是无毒的[4-8]。对不同形态的砷化合物分别进行定量分析是讨论砷毒性的基础。国内外常用的砷形态分析方法为高效液相色谱(HPLC)分离与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)[9]定量检测技术联用，分离方法主要包括离子对色谱和离子交换色谱。由于水体中常见的砷形态化合物在大多数条件下是以离子型化合物存在，已报道的砷形态检测技术通常是利用离子交换机理进行分离，流动相一般选择缓冲盐溶液[10-15]。As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、一甲基砷和二甲基砷的离解常数(pKa)指示这四种形态的砷化合物为弱酸或中强酸[16]。流动相的pH值不仅影响着流动相缓冲盐的组分构成，也影响着不同形态砷化合物的离子形式，在液相分离过程中起着至关重要的作用。

目前关于砷形态分析的研究大多关注样品前处理技术或方法特性指标，部分文献中流动相的pH值参数是直接给出的，部分文献仅以分离效果为依据优化流动相的pH，且采用的pH不相同甚至不相近。陈绍占等[17]分析大鼠血清中砷形态时以碳酸铵溶液为流动相，没有体现pH值的优化过程，直接采用pH=9.7；王林裴等[18]分析水产动物中5种砷形态含量时，考察了酸碱度在6.57～8.57范围内的三个pH值，选择了pH=8.0的磷酸二氢铵作为流动相；Slejkovec等[19]采用pH=6.1的磷酸二氢铵溶液进行不同形态砷化合物的分离，在加入甲醇的条件下采用pH=5.0的流动相；Komorowicz等[13]采用pH=9.1条件分离AsB、二甲基砷、As(Ⅲ)、一甲基砷和As(Ⅴ)，结果显示pH=8.6的20mmol/L碳酸铵能够更好地分离AsB和As(Ⅲ)。

实际上，流动相的pH会影响到分离周期、灵敏度及色谱柱寿命等诸多方面。本文以常见的具有毒性的四种砷形态化合物(三价砷、五价砷、一甲基砷、二甲基砷)为研究对象，采用HPLC-ICP-MS联用技术进行测定，从砷化合物的分离度、灵敏度和分析成本三个方面，研究了pH值在6.0～9.7范围内的流动相对HPLC-ICP-MS联用技术测定不同形态砷化合物的影响。

1 实验部分

1.1 仪器

NexION 300Q电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，美国PerkinElmer公司)。Agilent 1200高效液相色谱仪(HPLC，美国Agilent公司)，配自动进样器。色谱柱与ICP-MS雾化器使用PEEK管(长度5cm，内径0.007英寸)连接。HPLC的自动进样器与ICP-MS使用触发线进行信号连接。

1.2 标准物质和主要试剂

亚砷酸根标准溶液(GBW08666)、砷酸根标准溶液(GBW08667)、一甲基砷标准溶液(GBW08668)、二甲基砷标准溶液(GBW08669)：均购自中国计量科学研究院。

亚砷酸根、砷酸根、一甲基砷和二甲基砷溶液：分别取以上标准溶液配制成1mg/L(以砷计)的混合中间使用液，标准溶液系列分别取定量的中间使用液现用现配，用流动相定容，浓度为1.0～200μg/L。

碳酸氢铵(优级纯)、磷酸氢铵(优级纯)、氨水(分析纯)：均购自国药集团北京化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

本研究采集洁净的地下水，用0.45μm滤膜过滤后，除去悬浮颗粒物后直接上机进行测定后，未检测出砷元素，作为实验用水。实验用水用于空白对照及加标样品的条件实验。

以89Y作为内标元素，对仪器信号的波动进行校准。所有样品分析条件的实验设置6组平行，每个条件下进行单一标准品的定性分析，确定出峰顺序。

HPLC条件：色谱柱为IonPac AS19，5μm，4.6mm×250mm；流动相初始为30mmol/L碳酸氢铵溶液，等度洗脱；流速为1.0mL/min；进样体积为25μL。

ICP-MS条件：等离子体射频功率为1050W；等离子体气流量为16L/min；辅助气(雾化气)流量为0.9L/min；采样深度为-0.5mm；辅助气(冷却气)流量为1.2L/min。样品由色谱柱直接导入雾化器，不经过ICP-MS进样系统的蠕动泵。

数据采集：每次样品分析前均进行仪器调谐，氧化物产率和双电荷产率均小于3%。砷元素采用75As，积分模式为峰面积。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

文献[20-23]中一般选用缓冲盐作为流动相来完成不同砷形态化合物的分离，最常用的是磷酸盐和碳酸盐。磷与砷同属第Ⅴ主族，磷酸盐对砷形态的化合物有很好的洗脱作用。但是本研究尝试以8mmol/L磷酸二氢铵溶液作为流动相等度洗脱，得到的砷化合物的分离效果见图1，先出峰的As(Ⅲ)和二甲基砷无法实现基线分离。碳酸氢盐作为流动相时，不同形态砷化合物的分离效果较好，但是As(Ⅴ)的保留时间较长。倪张林等[22]采用先碳酸氢盐后磷酸氢盐的梯度洗脱。在联机测试过程中，流动相最终会进入ICP-MS仪器中，磷酸属于难挥发性酸，对ICP-MS的采样锥有一定的损害，而碳酸盐可以在高温下分解挥发，不会积累在采样锥表面。因此，本研究采用碳酸氢铵溶液作为流动相进行pH值影响的研究。

图1 以磷酸盐作流动相时四种砷形态化合物的分离效果Fig.1 Chromatograms of arsenic species on the eluents of phosphate

本研究就五种不同浓度(10、20、30、40、50mmol/L)的碳酸氢铵流动相进行了考察，由四种形态砷化合物的出峰时间(表1)表明，流动相浓度越高出峰越快。另外，随着流动相浓度升高，峰形改善，尤其是As(Ⅴ)的峰形变化明显，这与韩梅等[24]的研究结果一致。在能够实现基线分离的前提下，出峰总时间越短越好。当浓度≥30mmol/L时，最后出峰的化合物As(Ⅴ)的出峰时间随浓度增大变化不再明显。而当溶液离子浓度较大时，ICP-MS存在同量异位素重叠和多原子离子等质谱干扰，还可能产生较强的基体效应[25-26]，应尽量选择低浓度流动相溶液，本文选择了30mmol/L作为流动相碳酸氢铵的浓度。

表1流动相不同浓度下砷化合物的出峰时间

Table 1 Retention time of four arsenic compounds on different eluents concentration

流动相浓度(mmol/L)出峰时间(min)As(Ⅲ)As(Ⅴ)一甲基砷二甲基砷103.98018.07111.3353.089203.5329.8666.9702.849303.2876.6765.1622.722403.0845.6204.5352.671503.0255.2474.2312.667

2.2 流动相pH值的影响

研究的四种形态的砷化合物As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、一甲基砷和二甲基砷的结构式分别为H3AsO3、H3AsO4、CH3AsO(OH)2和(CH4)2AsOOH。H3AsO3和(CH4)2AsOOH仅能发生一级电离，离解常数分别为9.2和6.2；CH3AsO(OH)2能够发生二级电离，一级和二级离解常数为3.6和8.2；H3AsO4能够发生三级电离，离解常数分别为2.3、6.8和11.6。

结合不同形态砷化合物的离解常数及文献[16-18]中所使用的pH值条件(6.0、8.0、9.7)，设计了五种pH值(6.0、7.0、8.0、9.2、9.7)的流动相来分离不同形态的砷化合物。流动相初始溶液为30mmol/L碳酸氢铵溶液，四种砷形态化合物的浓度为200μg/L，按照实验设计调节流动相的pH值，更换流动相时至少平衡1h再进行联机测试实验，分别记录不同pH值条件下四种形态砷化合物的保留时间和峰强度。

2.2.1pH值对保留时间的影响

以pH值为横坐标，以四种砷形态化合物的保留时间为纵坐标作图，如图2所示，pH为6.0～7.5和pH>9.5时四种砷形态化合物的保留时间相差较大，色谱峰之间的距离比较大，可以实现分离。在5种pH值(6.0、7.0、8.0、9.2、9.7)的流动相条件下，采用单一形态的砷化合物标准溶液进样分析，根据各种化合物的保留时间判断：随着pH值的升高，且As(Ⅲ)和二甲基砷的出峰顺序发生了交换。

图2 不同pH值条件下四种砷形态化合物的保留时间Fig.2 Retention time of four arsenic compounds in different pH conditions

随着流动相pH值的增大，首先是流动相的成分构成发生了变化，一价的碳酸氢根减少，二价的碳酸根形式增多，流动相的洗脱能力随之增强。

图3 (a)pH=6.0和(b)pH=9.7时四种形态砷的分离色谱图Fig.3 Chromatograms of four arsenic compounds at (a) pH=6.0 and (b) pH=9.7

对比图3a和b色谱图可知，pH=6.0时最后一个峰As(Ⅴ)保留时间为10.708min，pH=9.7时最后一个峰As(Ⅴ)保留时间为4.726min，在不影响分离度的前提下，保留时间越短，时间成本和HPLC和ICP-MS分析成本越低，尤其是ICP-MS氩气的消耗成本(50元/小时)直接与采集时间有关。

2.2.2pH值对峰强度的影响

以pH值为横坐标，以四种砷形态化合物的峰强度为纵坐标作图，对不同pH值条件下四种砷形态化合物的灵敏度进行了比较，结果如图4所示。首先需要说明，在相同的pH值和砷浓度的情况下，二甲基砷的信号强度最高，其次是As(Ⅴ)和一甲基砷，As(Ⅲ)的信号强度最低。直接采用ICP-MS(不联机)分别测定砷含量相同的四种不同形态的砷化合物，证实信号强度差异与液相色谱联机无关，与ICP-MS的硬件及等离子体条件有关，可能是因为不同砷形态化合物的雾化效率、传输效率与离子化效率存在差异。Raimund[30]采用HPLC-ICP-MS测定鱼肉组织中的砷甜菜碱，也发现了由ICP-MS引起的砷甜菜碱与As(Ⅲ)信号响应的差异。

图4 不同pH值条件下四种砷形态化合物的信号强度比较Fig.4 Comparison of signal strength for four arsenic compounds under different pH

由图4可知，pH值在6.0～9.7范围内，随着pH的增大，四种形态的砷化合物信号强度降低超过70%，且在实验结束时使用弱酸性流动相冲洗色谱柱时砷背景信号较高，说明用碱性的流动相进行实验后色谱柱上有砷化物的保留。pH的增大引起了四种形态砷化合物电离程度的增加，甚至发生了三级电离，色谱柱对砷化物的强保留使得部分砷化合物无法洗脱下来。邹昊辰[31]在研究砷吸附的过程中发现，pH值对砷化合物的静电力有明显的影响。

在使用偏碱性的流动相进行实验后，下次样品分析时容易出现干扰峰，且背景信号过高，长期使用会造成色谱柱分离效果变差。实验结束时，可使用强洗脱效果的流动相(如磷酸盐溶液)进行色谱柱冲洗，以免色谱柱失效，再进一针空白，来观察色谱柱的残留情况[32]。

3 结论

本文从分离度、灵敏度及运行成本三个方面阐述了流动相pH值影响HPLC-ICP-MS测定不同形态砷化合物的规律。若对超痕量的砷形态化合物进行检测时，选择pH=6.0的流动相，具有较高的灵敏度；若进行快速分析，偏碱性的流动相条件下，各砷形态的化合物出峰较快，分析周期较短，具有明显的时间成本和运行成本优势。偏碱性的流动相使得部分砷化合物保留在色谱柱中，可能造成色谱柱寿命减短。该规律对HPLC-ICP-MS形态分析测定过程中提高灵敏度、降低分析成本、消除干扰等具有指导意义。同时该研究成果也能应用于HPLC-ICP-MS联机测试方法的开发和优化。