黄芪菟箭合剂对糖尿病大鼠肾脏足细胞保护作用机制的研究

史晓虎 朴元林 尹德海 石 玥 孙 莹

糖尿病一旦出现持续蛋白尿，病情常难以逆转，往往发展为终末期肾脏病[1～3]。足细胞脱落、凋亡以及功能缺失是糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)发生的始动环节，研究足细胞结构和功能异常的机制，从而寻找防治措施可能是获得DKD有效治疗手段的关键途径。既往研究证实黄芪菟箭合剂可以减少糖尿病大鼠尿蛋白[4]。本研究从白蛋白尿排泄相关的足细胞作为研究的着眼点，探讨黄芪菟箭合剂对足细胞保护及其调亡相关指标的影响，为临床治疗DKD提供实验依据。

材料与方法

1.主要材料：(1)实验动物：清洁级雄性SD大鼠，体质量140～160g，鼠龄5周，购自北京斯贝福神武技术有限公司(No.11401500013730)，饲养于中国医学科学院医药生物技术研究所动物房[动物房许可证号：SCXK(京)2016-0002]。(2)造模与分组：大鼠适应性饲养3天后，随机取6只作为正常对照组(CON组)；其余大鼠禁食12h后予2%链脲佐菌素(streptozocin, STZ)(临用前溶于pH值4.2枸橼酸盐缓冲液)65mg/kg体重一次性腹腔注射。72h后，尾静脉取血测禁食12h血糖，以血糖≥16.7mmol/L，为造模成功。未成模大鼠均处死。糖尿病大鼠随机分为3组，即糖尿病对照组(DM组)6只、黄芪菟箭合剂治疗组(CM组)8只、缬沙坦组(V组)8只。CM组以10g/(kg·d)灌胃黄芪菟箭合剂；V组以40mg/(kg·d)灌胃缬沙坦。

2.主要试剂：(1)黄芪菟箭合剂颗粒剂[4]购自北京康仁堂药业有限公司。(2)其他试剂： STZ(美国Sigma公司)； 抗Neprin抗体[EPR20993](ab216341)、抗ZO-1 tight junction蛋白抗体(ab96587)、抗NF-κB p65抗体[E379](ab32536)、抗caspase-3抗体[E87](ab32351,英国Abcam公司)； Tris.Hcl(0826)、氯化钠(E529)、甘氨酸(M103)、SDS(0837,美国Amersco公司)；TEMED(17131201,美国GE公司)、APS(A3678,美国Sigma公司)、巯基乙醇(M3148,美国Sigma公司)。

3.组织标本的收集和处理：干预治疗12周后，处死前一天将大鼠置于代谢笼中，禁食不禁水收集夜间12h尿液，待测尿肌酐和尿白蛋白。大鼠的体重、右肾重用电子天平测量。颈动脉取血，离心取血清待测；开胸，予20mmol/L氟化钠(溶于PBS)行经心脏体循环灌洗肾脏，直至肾脏颜色变淡，迅速剥离双肾，置于冰上，取部分肾皮质置于10%甲醛溶液固定用于常规石蜡包埋和病理切片；其余肾皮质迅速置于干燥冻存管中，置入液氮中保存，应用Western blot法检测。

4.检测指标及方法：(1)使用全自动生化分析仪 (日本第一化学制品公司提供试剂盒，日本Olympus 1000)检测血肌酐(SCr)、尿素(Urea)、血糖(Glu)、和尿肌酐(Ucr)。(2)使用ELISA试剂盒检测大鼠尿白蛋白，并根据尿白蛋白和尿肌酐值计算大鼠尿白蛋白肌酐比(ACR)。(3)参考文献[5],以体重进行校正，计算肌酐清除率(CCR)。采用公式：CCR=Ucr×尿量(12h)/Scr×1000/体重(g)/720min。(4)Western blot法检测肾组织ZO-1、nephrin、NF-κB、caspase-3蛋白表达：配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶 (SDS-PAGE)凝胶，50mg加入500μl RIPA蛋白裂解液，匀浆裂解组织，14000r/min，4℃离心10min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，每孔上样30μg，电泳后转移至PVDF膜, 5%脱脂奶粉封闭PVDF膜，洗膜后分别加入稀释一抗，4℃过夜, 洗膜3次后，加入二抗，室温孵育, 洗膜后加增强化学发光试剂(ECL)后置于化学发光检测仪检测信号。用ImageJ软件对 Western blot法检测条带进行定量分析，以目的条带和GAPDH条带积分光密度值比值作为最终结果。

结 果

1.各组大鼠体重、血糖、尿量、肾/体重比：与CON组比较，所有糖尿病大鼠组包括DM组、CM组及V组的血糖、肾/体重比、12h尿量均显著增高(P<0.05)，体重则显著下降(P<0.05)。与DM组比较， CM组和V组12h尿量及肾/体重比均显著降低(P<0.05)，但CM组和V组12h尿量及肾/体重比比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 各组大鼠体重、血糖、尿量、肾/体重比

CON组.正常对照组；DM组.糖尿病对照组；CM组.黄芪菟箭合剂治疗组；V组.缬沙坦组；与CON组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05

2.各组大鼠血肌酐、尿素、尿肌酐、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率：与CON组比较，糖尿病各组大鼠Urea、ACR、CCR均明显升高(P<0.05)，Ucr则明显下降(P<0.05)。CM组和V组 的ACR、CCR显著低于DM组(P<0.05)，CM组与V组之间的ACR及CCR比较，差异无统计学意义(P>0.05,表2)。

表2 各组大鼠血肌酐、尿素、尿肌酐、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率

CON组.正常对照组；DM组.糖尿病对照组；CM组.黄芪菟箭合剂治疗组；V组.缬沙坦组；与CON组比较,*P<0.05;与DM组比较,#P<0.05

3.各组大鼠肾皮质ZO-1、nephrin、NF-κB、caspase-3蛋白表达情况：(1)ZO-1及nephrin蛋白表达：糖尿病各组大鼠的肾皮质ZO-1及nephrin显著低于CON组(P<0.01)；CM 组和V组的肾皮质ZO-1及nephrin蛋白表达显著高于DM 组(P<0.05,图1、表3)。(2)NF-κB及caspase-3蛋白表达：DM组肾皮质中NF-κB和caspase-3蛋白表达显著高于CON组(P<0.01)；与DM组比较，CM组肾皮质NF-κB和caspase-3蛋白表达均显著下降(P<0.01)；与DM组比较，V组肾皮质caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.01)，而其NF-κB蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05，图1及表3)。

图1 各组大鼠肾皮质ZO-1、nephrin、NF-κB、caspase-3蛋白表达情况

讨 论

足细胞病变导致的足细胞脱落分离，可致白蛋白尿的出现[6]。在糖尿病肾病的早期阶段，足细胞对裂孔隔膜蛋白或细胞骨架蛋白、如紧密连接蛋白ZO-1(zonulaaoccludens protein-1)、nephrin的合成表达减少，足细胞对肾小球基膜的黏附性下降，足细胞脱落，造成足细胞间的裂孔隔膜的完整性破坏，从而导致蛋白尿的出现[7]。本研究以STZ诱导糖尿病大鼠模型，经12周，糖尿病大鼠出现肾脏体积增大、肾/体重比增加、ACR、CCR显著升高，提示糖尿病大鼠肾脏出现高滤过高灌注状态，已经出现了DKD典型的白蛋白尿，成功建立了DKD大鼠模型。与正常大鼠比较，DKD大鼠的肾皮质免疫印迹相关结果提示，具有维持肾小球滤过膜完整性的的ZO-1及nephrin的表达显著降低。本研究经黄芪菟箭合剂干预12周，DKD大鼠的肾/体重比、ACR与CCR均显著下降，这证实黄芪菟箭合剂具有降低DKD尿白蛋白排除率，有效缓解DKD肾脏高滤过，且此机制与降糖无关。本研究观察到黄芪菟箭合剂能升高糖尿病大鼠肾组织具有足细胞保护作用的ZO-1及nephrin的蛋白表达，具有直接的足细胞保护作用。

NF-κB作为一个转录因子蛋白家族，是细胞内多个通路的中心环节，其活化可调节多种化学趋化因子和细胞黏附分子的转录与表达、成纤维细胞的增殖合分化、细胞外基质的交联反应以及细胞凋亡等过程。研究表明在DKD患者及STZ诱导的DM大鼠中均存在NF-κB激活，且DKD患者NF-κB激活与尿白蛋白排出率呈正相关[8]。抑制糖尿病状态下NF-κB途径的激活有可能通过抑制其下游事件的发生，包括炎性反应、巨噬细胞浸润、细胞凋亡等，从而减少尿白蛋白排出，起到肾保护作用。研究观察到DM大鼠肾皮质NF-κB蛋白表达显著升高，细胞凋亡相关caspase-3蛋白表达显著升高。黄芪菟箭合剂可抑制糖尿病大鼠肾皮质NF-κB表达，降低细胞凋亡相关的caspase-3蛋白的表达，提示黄芪菟箭合剂有可能通过抑制NF-κB途径和抑制凋亡，从而起到保护足细胞，减少白蛋白排出，进而延缓DKD进展。

表3 各组大鼠肾皮质ZO-1、nephrin、NF-κB、caspase-3蛋白相对表达量

CON组.正常对照组；DM组.糖尿病对照组；CM组.黄芪菟箭合剂治疗组；V组.缬沙坦组。与CON组比较,*P<0.01；与DM组比较,#P<0.05,##P<0.01

近年来研究表明，中医药治疗DKD的机制与其抑制导致病情恶化的指标并改善保护肾脏及延缓病情发展的指标有关[9～13]。中医药认为DKD(中医的消渴肾病)的主要特点为“消渴小便白浊”，与西医把白蛋白尿作为DKD显著临床特征一致[14]。历代医家多数认为脾肾两虚、瘀血水湿内阻是其主要病机：脾肾虚衰，气虚不固摄，精微不固，从溺而出；气虚不行血，血滞成瘀血；气化失常，水湿停聚则见水肿。黄芪菟箭合剂以黄芪、菟丝子补益脾肾为君；以鬼箭羽活血、汉防己利水泄湿浊共为臣药，具有补益脾肾、益气固精、活血利水(湿)的作用。中药黄芪菟箭合剂立法、配伍组成符合消渴肾病的主要中医病机，实验证实对DKD大鼠能减少尿白蛋白排出(尿浊减少)，有较大的临床应用价值。