酸性微环境对大肠癌细胞自噬及侵袭能力的影响

占义军 许东强 李 明 谭诗云

大肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见消化道恶性肿瘤，其发病率高居全球恶性肿瘤的第3位。尽管近年来大肠癌诊疗水平显著提高，但其病死率仍高居肿瘤相关死亡的第2位[1, 2]。侵袭转移是导致大肠癌患者临床治疗失败和死亡的主因。研究发现，肿瘤的侵袭转移与肿瘤细胞所处的肿瘤微环境有着密切关系[3～5]。酸性微环境(acidic microenvironment)是肿瘤的普遍特征，其与肿瘤低糖条件下的生存、侵袭转移等均有关系，在肿瘤的发生和发展过程中均扮演重要角色[6, 7]。自噬可使细胞能够适应缺氧、饥饿等恶劣环境并应对其他各种包括化疗或放疗造成的损伤刺激等，有助于细胞的存活。本研究拟在细胞培养基中加入乳酸，调节pH值为6.8，模拟酸性环境，来探讨酸性环境下对大肠癌LoVo细胞侵袭能力及自噬水平的影响。

材料与方法

1.材料：大肠癌细胞系LoVo细胞购自中科院上海细胞库。胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM/F-12培养基购自美国Invitrogen公司；Transwell小室、细胞培养瓶、细胞培养皿及6孔培养板均购自美国Corning公司；Matrigel胶购自美国BD公司；EMT标志物抗体(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin)、自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白、MMP-9及内参β-actin抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。蛋白浓度测定试剂盒、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠及FITC-山羊抗兔荧光二抗均购自中国杭州碧云天生物技术研究所。

2.方法：(1)细胞培养：大肠癌LoVo细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基培养，37℃、5%CO2条件下培养。实验细胞选用处于对数生长期的细胞。(2)Transwell实验：该实验分为对照组(pH值7.4)和乳酸组(20mmol/L, pH值6.8)两组。选取Transwell小室，将对数生长期的上述2组细胞用不含血清的培养基重悬计数，接种200μl于24孔板Transwell小室上室(细胞密度为2×105/ml)，每组设3个复孔；将600μl含10%血清的培养基加入24孔板Transwell小室下室，37℃、5%CO2条件下培养24h；小心取出小室，吸干小室内培养基，PBS洗涤3次，用PBS湿润的棉签轻拭小室内的细胞，倒置晾干，4%多聚甲醛室温下放置固定30min，倒置晾干，0.1%结晶紫染液室温下染色15min，显微镜下取5个随机视野计数，统计结果，实验重复3次。(3)蛋白质印迹：接种对数生长期细胞(细胞浓度为2×105/ml)至6孔板内，每孔2ml，放置培养箱中孵育至细胞贴壁后，加入含乳酸的完全培养基分别处理细胞0、12、24h后，从培养箱中取出培养板，消化收集细胞，并用预冷的PBS洗涤后加入蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)冰上裂解反应30min，用细胞刮刮下细胞，置于EP管中，冰上静置5min，离心(离心机预冷4℃)12000r/min离心 10min(r=8cm)，取上清，采用BCA法测定蛋白浓度，每个样品以相同的蛋白量(40μg)加入10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法将10%聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移至PVDF膜，经5%脱脂奶粉室温条件下封闭1h，4℃条件下过夜孵育一抗，次日TBST洗膜后，室温调价小孵育二抗2h， TBST洗涤后ECL化学发光试剂显影，定影，对胶片进行拍照分析，实验重复3次。

结 果

1.酸性环境对大肠癌LoVo细胞侵袭能力的影响：如图1所示，Tanswell实验结果显示，酸性条件(pH值6.8)下处理24h后，穿过Transwell小室基膜的大肠癌细胞系LoVo细胞数为491.4±19.5个，显著多于中性条件(pH值7.4)的353.8±24.6个，差异有统计学意义(t=7.59,P=0.002)。

图1 酸性环境对大肠癌LoVo细胞侵袭能力的影响(#P<0.05)A.Tanswell小室检测中性环境(pH值7.4)和酸性环境(pH值6.8)对LoVo细胞侵袭能力的影响(结晶紫，×100)；B.与中性环境(pH值7.4)穿过Transwell小室细胞数(353.8±24.6)比较，酸性环境(pH值6.8)下穿过Transwell小室人工基膜的LoVo细胞数(491.4±19.5)增加(t=7.59, P=0.002)

2.酸性环境对大肠癌LoVo细胞MMP-9表达的影响：如图2所示，酸性条件分别处理LoVo细胞0、12、24h后，蛋白质印迹检测结果显示随着作用时间的延长，MMP-9表达逐渐增加。

图2 酸性环境对大肠癌LoVo细胞MMP-9蛋白表达的影响A.免疫印迹图；B.MMP-9灰度值分析;与0h比较，*P <0.05

3.酸性环境对大肠癌LoVo细胞EMT标志物蛋白表达的影响：本实验进一步探讨了酸性条件下对大肠癌LoVo细胞EMT标志物表达的影响，如图3所示，随着作用时间的延长，上皮标志物E-钙黏素(E-cadherin)表达逐渐下调，且间叶标志物波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)表达逐渐上调。

图3 酸性环境对EMT标志物表达的影响A.免疫印迹图；B.EMT标志物灰度值分析;与对应蛋白0h比较，*P<0.05

4.酸性环境对大肠癌LoVo细胞自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达的影响：如图4所示，酸性条件分别处理LoVo细胞0、12、24h后，蛋白质印迹检测结果显示随着作用时间的延长，自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达逐渐上调。

图4 酸性环境对LoVo细胞自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达的影响A.免疫印迹图；B.自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1标志物灰度值分析;与对应蛋白0h比较，*P<0.05

讨 论

普遍认为肿瘤酸性微环境产生的机制主要包括以下因素：细胞转化和生长失控导致的缺氧和代谢异常；肿瘤存在独特的代谢型——瓦伯格效应，即肿瘤细胞无论在有氧还是低氧环境下均进行糖酵解，产生乳酸并排出细胞外，而肿瘤中紊乱的血管不能有效清除组织环境中的乳酸；特别地，在提高肿瘤组织的氧分压和血流量情况下，肿瘤依然产生并维持着酸性微环境[8]。这种酸性环境可促进肿瘤细胞侵袭、化疗耐药、细胞免疫逃逸等[8,9]。本研究结果显示，与中性条件下比较，酸性条件下，大肠癌LoVo细胞侵袭能力更强，且基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表达上调，后者可降解细胞外基质并破坏基膜，促进肿瘤细胞从原发灶向周围组织及远处转移。

上皮细胞间叶样表型转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT), EMT是肿瘤原发性浸润和继发性转移的重要机制，EMT是在胞外因素刺激下由上皮细胞表型转化为具有间质细胞表型的过程[10～12]。在EMT过程中，细胞极性、细胞间紧密连接和黏附连接逐渐丧失，肌动蛋白细胞骨架发生重组，细胞-细胞间连接蛋白如E-cadherin、γ-catenin等表达减少，而间叶标志物如N-cadherin、Vimentin、Fibronctin等表达明显增加。同时，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteins,MMPs)如MMP-2、MMP-3及MMP-9等活性显著增加。特别地，研究表明，EMT的激活能使非肿瘤干细胞具有肿瘤干细胞的特性如自我更新及肿瘤启动能力[13,14]。因此，EMT过程被认为是绝大多数肿瘤细胞发生侵袭、转移的前提。本研究结果显示，酸性条件处理后可使结肠癌细胞系LoVo细胞的侵袭能力增加，且肿瘤细胞上皮标志物E-cadherin表达降低，且间叶标志物Vimentin、Fibronctin表达上调，提示酸性条件下可促进LoVo细胞EMT。

肿瘤细胞应对酸性应激的机制仍不明确。自噬是广泛存在于真核细胞内利用溶酶体降解自身受损的细胞器和高分子物质的过程，是细胞应对恶劣环境的生存机制，其在肿瘤发生、进展中发挥着复杂的作用[15～18]。在肿瘤形成前，机体可通过自噬维持细胞内稳态阻止细胞恶变。但当肿瘤形成后，自噬可帮助肿瘤细胞度过不利的微环境，对肿瘤细胞起到一定的保护作用，并促进细胞侵袭[19]。但即使肿瘤形成后，也有研究显示自噬对肿瘤细胞可产生抑制作用[20]。自噬的这种双重调节作用已经在临床研究中不断被证实[21,22]。酸性微环境是肿瘤的普遍特征，研究发现酸性条件下，人类乳腺癌细胞内Atg5和Bnip3表达水平升高，提示细胞暴露在低pH值可能利用自噬作为一种生存机制[23,24]。本研究也发现酸性条件下，LoVo细胞自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达上调，提示LoVo细胞自噬水平升高。推测肿瘤细胞可能通过调节自噬来耐受酸性微环境来继续生存。

综上所述，酸性条件下LoVo细胞侵袭能力显著增加，肿瘤细胞上皮标志物E-cadherin表达降低，且间叶标志物Vimentin、Fibronctin表达上调。同时，酸性条件下也可诱导LoVo细胞发生自噬。提示肿瘤酸性微环境对肿瘤细胞自噬状态及间质化特征有着重要作用，且提示细胞自噬与细胞上皮间质转化之间存在相互影响的关系，下一步将深入探讨酸性环境诱导的自噬在大肠癌侵袭、转移中的作用及机制，并阐明酸性微环境诱导自噬的机制，为寻找新的抑制大肠癌侵袭、转移治疗方案提供理论基础。