PRF对糖尿病大鼠创面Wnt/β-catenin信号通路的影响

卓 然 王 杨 刘 刚 章登辉 龚 慧

我国糖尿病患者已超过1亿人，大约30%的患者会发生皮肤破溃，由于局部神经和血管病变，糖尿病溃疡常反复发生，难以愈合，严重者可因重度感染危及生命[1]。虽然目前治疗糖尿病的方案众多，但总体治疗效果并不理想。孙晓磊等[2]研究表明糖尿病大鼠β-catenin表达降低，表皮细胞增殖能力下降，故认为Wnt/β-catenin信号转导紊乱与糖尿病创面难以愈合有关。富血小板纤维蛋白(PRF)是一种富含细胞因子和生长因子的自体来源的新型生物材料，Ding等[3]报道其可有效促进糖尿病大鼠皮肤创面愈合。但是PRF促进糖尿病创面愈合是否与Wnt/β-catenin信号通路的转导有关鲜有报道。因此，本研究通过检测创面不同时间点β-catenin的表达水平，探索PRF对糖尿病创面愈合Wnt/β-catenin信号通路的影响。

材料与方法

1.实验动物:40只8周龄雄性SD大鼠购于辽宁长生生物公司/辽宁何氏医学院[许可证号：SCXK(辽)2015-0001，合格证号：211002300035410]，体重200～230g，平均体重218±3.57g。在标准环境下给予高脂高糖饲料喂养4周，健康状态良好后用于实验。

2.主要试剂与仪器设备：(1)主要实验试剂：链脲佐菌素(美国Sigma公司)、枸橼酸钠缓冲液(美国索莱宝公司，货号：C1013)、DAB显色试剂盒(福州迈新生物公司，批号：1805300031)、大鼠SP超敏试剂盒(福州迈新生物公司，批号：1805159710)、β-catenin一抗(美国Proteintech公司，批号：60008-1)、PBS磷酸盐缓冲液(福州迈新生物公司，批号：18052202)、抗原修复缓冲液(福州迈新生物公司，批号：18042404)。(2)主要实验仪器：电子天平(中国上海精密公司)、罗氏活力血糖仪及试纸(德国罗氏公司)、石蜡切片机(德国徕卡Leica)、75℃恒温烤箱(中国福意公司)、光学显微镜(德国Lioo公司)、台式离心机(中国吉迪仪器公司)、未加抗凝剂的玻璃采血管、透明网格纸。

3.实验方法：(1)糖尿病大鼠模型建立：大鼠禁食12h，腹腔注射1%链脲佐菌素溶液45mg/kg，1周后于尾静脉测空腹血糖值。若空腹血糖值≥16.7mmol/L，则视为造模成功；若血糖值<16.7mol/L，则视为不成功，以剂量为30mg/kg的链脲佐菌素再次诱导，如仍不成功则剔除实验[4]。(2)糖尿病大鼠创面的制备：所有大鼠均以1%的水合氯醛(300mg/kg)进行腹腔注射麻醉，麻醉后用10%的硫化钠去除大鼠背部及侧腹部毛发。用边长22mm的正方形硬纸板及标记笔在大鼠脊柱两侧各做一正方形标记，造模前常规消毒，使用无菌手术剪及手术镊沿标记线剪出一边长22mm的正方形缺损(面积为484mm2),创面深达浅筋膜层，此即为糖尿病大鼠创面模型。(3)PRF制备:用未加抗凝剂的真空采血管抽取8位志愿者的静脉血，迅速置于离心机中，立即以3000r/min的速度离心10min。离心后试管内血液分为3层，PRF位于底层深红的红细胞碎片和顶层淡黄色的贫血小板血浆澄清液之间，呈淡黄色凝胶状。用无菌注射器针头取出采血管内凝胶条，修剪并保留PRF尾部少许红细胞成分，即制备完成(图1A、图1B)。(4)分组及干预：选择大鼠左侧创面做为PRF组，右侧创面为对照组。将制备的PRF膜片置于大鼠左侧创面上，凡士林纱布覆盖两侧创面后，无菌纱布包扎(图1C)。每只大鼠均单笼饲养并依次编号，换药时各创面均用1%碘伏消毒再以无菌纱布擦干后常规包扎。创面每日换药1次，分别于操作后的3、7、14天使用随机数字表法挑取大鼠注射过量麻药处死并取创缘3mm内皮肤组织做进一步检查。

图1 PRF制备及应用A.血液离心后；B.PRF凝胶；C.PRF覆盖创面

4.观察创面愈合情况：(1)创面面积及愈合率：术后即刻及3、7、14天采集创面照片，拍照时用刻度尺测量创面横轴及纵轴长度，并用透明网格纸沿创面边缘绘制创面图形，拍取照片后用Image J软件计算创面未愈合面积。愈合率计算公式为：愈合率=(创面原始面积-未愈合面积)/创面原始面积×100%。(2)HE染色：术后3、7、14天取创缘组织置于4%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片，脱蜡水化后苏木素、伊红染色。光镜下选取5个200倍视野，观察创面炎性反应，并用图像分析软件测肉芽组织厚度。(3)SP免疫组化染色：根据SP免疫组化步骤进行β-catenin的染色。光镜下细胞质呈棕色为β-catenin阳性，每张切片随机选取5个不重复的视野(×400倍)，计数100个细胞中的阳性细胞个数，取平均值作为阳性细胞的表达率。

结 果

1.糖尿病大鼠成模情况:40只大鼠经腹腔注射STZ后，逐渐出现多饮、多食、多尿、毛发无光泽、精神萎靡、活动减少、蜷卧拱背等症状。大鼠腹腔注射STZ 1周内共死亡4只，且主要集中在注射STZ后第3天。第1次注射STZ后共有16只大鼠空腹血糖值低于16.7mol/L，16只大鼠经补注STZ后共死亡1只，1周后测空腹血糖小于16.7mol/L的共5只，给予剔除实验。故经腹腔注射STZ后共计筛选出造模成功的糖尿病大鼠30只，体重180～210g，平均体重193±4.52g，较造模前体重有所减轻。随后的实验中无大鼠异常死亡。

2.两组创面愈合情况：造模后第3天，创面干燥、色泽红润，较少分泌物；PRF组与对照组创面愈合率比较差异无统计学意义(22.1%±4.2% vs 20.5%±4.9%，t=1.358，P=0.180)。7、14天可见肉芽组织生长活跃、呈红色、创缘形状不规则，收缩与上皮化现象明显；PRF组创面愈合率均明显高于对照组，差异有统计学意义(68.7%±10.6% vs 46.6%±9.2%，83.7%±2.2% vs 72.1%±3.4%，t=7.042、9.058，P均=0.001)，详见图2。

图2 术后不同时间点两组创面大体观

3.两组创面HE染色的比较：造模后第3天，两组创面均可见大量中性粒细胞浸润，周围组织水肿明显，但PRF组肉芽组织水肿程度较对照组轻，肉芽组织厚度差异有统计学意义(1054±107 vs 1350±112，t=-6.043，P=0.001)。造模后第7、14天，PRF组中性粒细胞浸润程度减轻明显，伴有毛细血管增生，周围组织水肿减轻，肉芽组织结构致密，与对照组比较差异有统计学意义(523±102 vs 1128±127，569±118 vs 682±124，t=-11.745、-2.272，P=0.001、0.036)，详见图3。

图3 术后第14天两组创面(HE，×200)A.PRF组；B.对照组

4.两组创面β-catenin染色的比较：造模后第3、7、14天，两组创面均出现细胞质粗细不一的棕黄色阳性着色颗粒，但PRF组阳性细胞计数明显多于对照组，差异有统计学意义(39.2±7.8 vs 23.6±6.2，44.5±6.8 vs 25.8±5.8，44.9±5.5 vs 25.6±6.1，t=4.951、6.616、7.431，P均<0.05)，详见图4。

图4 术后第14天两组创面β-catenin(免疫组化,×400)A.PRF组；B.对照组

讨 论

糖尿病创面难愈的具体机制尚不完全清楚，目前认为其与皮肤的特殊微环境、体内免疫应答功能障碍及相关细胞因子数量的改变有关，任何一个环节发生障碍均可使创面愈合延迟[5]。然而糖尿病患者又易于发生皮肤破溃，糖尿病人群中足部溃疡年发生率为8.1%，年截肢(趾)率为5.1%，长期的治疗费用以及较差的预后效果极大的影响了患者的生存质量，因此有必要探索新的治疗手段，使创面的治疗方案多元化[6]。

PRF是一种富含细胞因子和生长因子的自体来源的新型生物材料，其促进创面愈合主要通过3个方面实现，分别为细胞因子的调节作用、纤维蛋白的支架作用及白细胞的免疫调节作用[7, 8]。首先，PRF含有多种生长因子，主要类型有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGFβ-1)、血小板衍生生长因子(PDGF-AB)和表皮生长因子(EGF)。这些生长因子能够调节蛋白质表达及成纤维细胞增殖，促进创伤愈合、组织修复。有研究表明β-catenin能够通过调节TGF-β1来诱导成纤维细胞转化，尤其是皮肤成纤维细胞[9]。其次， PRF凝胶组织具有疏松、孔隙大、弹性好的特性，其结构与人类天然的组织结构非常相似。这一特性有利于组织在修复过程中发挥细胞支架作用；有利于营养物质和氧气弥散至细胞周围；有利于诱导细胞移动和增殖[10]。最后，PRF中滞纳了大量白细胞，其在离心过程中被激活，在PRF降解过程中可不断释放免疫调节相关的细胞因子，发挥抗感染的作用[11]。因此，PRF对糖尿病创面具有一定的疗效。

引起糖尿病创面的机制众多，信号通路转导的变化是其中之一。Wnt/β-catenin信号通路具有高度的保守性，其与皮肤发育、创伤愈合关系密切， 表达增强时可促进皮肤表皮细胞、角质细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞增殖、分化[12, 13]。正常情况下没有Wnt信号的传入，胞质内的β-catenin在丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化下进行降解，从而不发生表达。当有Wnt信号传入时，β-catenin由于不能被磷酸化降解，在胞质中积累到一定程度后转移到细胞核，激活Wnt靶基因的转录，从而激活该通路[14]。Chen等[15]研究表明β-catenin信号转导与皮肤发育、创伤愈合关系密切，可参与真皮和表皮结构的形成。Xu等[16]研究表明在创面修复过程中，β-catenin信号转导被激活并参与上皮的再生，提高了表皮细胞的增殖和迁移能力。

本研究揭示了PRF对糖尿病大鼠创面愈合情况及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。本实验在术后不同时间点记录并计算出创面面积。通过分析认为7～14天PRF组大鼠创面愈合率明显高于对照组，初步表明了PRF可以有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。HE染色显示PRF组中性粒细胞浸润明显减轻，肉芽组织结构更加致密。SP免疫组化示PRF组β-catenin阳性表达细胞数量高于对照组，提示了PRF能够干扰Wnt/β-catenin信号通路的转导，使其表达水平升高，这一结果与相关文献报道一致。

综上所述，PRF中多种生长因子的协同作用以及立体网状结构和免疫调节作用使其在糖尿病创面治疗中具有独特的优势。本研究表明，PRF能够有效促进糖尿病大鼠创面愈合，其作用机制与提高Wnt/β-catenin信号通路的转导有关。