血浆SFRP1和Septin9基因甲基化检测对结直肠癌诊断的临床价值

李 建1，樊 华2，贺晓斌1，吴耀禄2，李晓勇3

(延安大学附属医院 1.腺体血管外科，2.胃肠外科，3.肝胆外科，陕西 延安，716000)

早期筛查和科学的干预能够降低结直肠癌的发病率和病死率，传统使用的筛查方法为粪隐血试验、乙状结肠癌和直接肠镜检查等，而肠镜筛查由于自身侵入、取样不便、特异性低等因素得不到广泛的应用[1-2]。因此寻求一种较为简便、快捷、灵敏度高、特异性强的标志物成为目前研究的重点和难点[3-6]。国外学者报道，结直肠癌患者组织中SFRP1和Septin9基因的启动子区域CpC岛的嘧啶发生甲基化，而在正常人体内不会发生这种变化，因此可将这两种基因甲基化作为诊断结直肠癌的一个特异性标志物。本研究将本院近两年收治的47例结直肠癌患者作为研究对象，分析SFRP1和Septin9甲基化筛查结直肠癌和癌前病变的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将我院自2016年6月至2018年6月间接受结直肠镜检查的患者80例作为研究对象，男性49例，女性31例，年龄35～83岁，平均年龄(61.75±7.13)岁；所有对象接受荧光定量PCR检查外周血浆中SFRP1和Septin9基因甲基化的状态，并使用胶体金免疫化学法进行粪隐血检测。本次研究经医院伦理委员会批准，患者知情并签署同意书。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：(1)语言表达能力正常，能与调查人员进行正常的沟通；(2)研究对象自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：(1)既往有其他肿瘤疾病史者；(2)已接受放射疗法和化学疗法；(3)既往腹部外科手术史；(4)妊娠期或哺乳期妇女；(5)排除脑卒中、老年痴呆等神经系统疾病导致的无法采集相关信息和精神分裂症的患者；(6)患者或患者家属不愿意参与研究，及未签署知情同意书者。

1.3 血浆制备

采集10 mL外周静脉血置于EDTA抗凝真空采血管中，1 350 g离心机(离心半径为10 cm)离心12 min，吸取3.5 mL血浆进行检测，或者置于-20 ℃冰箱并在四周内完成检测。

1.4 SFRP1和Septin9基因甲基化检测

选择PCR荧光探针法试剂盒Epi proColon2.0 CE(Epigcnomics AG公司生产)，操作严格按照试剂盒说明书进行，共分为DNA提取、亚硫酸盐转化、Bis-DNA结合、洗脱、PCR反应、判定等几个步骤，尤为注意的是每一个样本连续进行三次PCR反应，2次或以上阳性判读为阳性。

1.5 粪隐血筛查

使用胶体金免疫化学法对每一个对象进行检测。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 检测结果

结果显示，80例接受结肠镜检查和组织病理学确诊为结直肠癌的患者有47例(58.75%)，其中男性29例，女性18例，年龄36～83岁，平均年龄63.36±6.82岁；非结直肠癌的对照组33例(41.25%)，男性20例，女性13例，年龄35～81岁，平均年龄(59.86±6.72)岁，两组患者性别比较差异无统计学意义(χ2=0.571，P>0.05)，年龄比较差异具有统计学意义(t=3.458，P<0.05)。

结直肠癌组检测SFRP1和Septin9基因甲基化阳性为34例，阳性率为72.34%，结直肠癌组患者SFRP1和Septin9基因甲基化检测结果详见表1。

2.2 SFRP1和Septin9基因和粪隐血筛查检测对结直肠癌的诊断情况

甲基化SFRP1和Septin9基因甲基化诊断结直肠癌的敏感度为80.0%，特异度为95.3%，粪便免疫学检测的敏感度为86.3%，特异度为54.3%，两者结合后敏感度为97.6%，特异度为96.8%，明显高于单独检测，详见表2。

表1 结直肠癌组患者SFRP1和Septin9基因甲基化检测结果

表2 SFRP1和Septin9基因和粪隐血筛查检测对结直肠癌的诊断情况 (%)

3 讨 论

SFRP1是一种新发现的抑癌基因，其表观遗传学修饰如甲基化与恶性肿瘤的发生发展密切相关。既往研究表明，SFRP1的甲基化会抑制SFRP1基因的表达，降低SFRP1蛋白水平，且这一现象与肺腺癌组织及结直肠癌的发生发展密切相关[4-5]。Septin9基因是在2008年首次报道的对结直肠癌筛查的特异性基因[6]。Septin9基因是septin基因家族的成员之一[7]，在除了植物细胞之外的真核生物中广泛存在，其主要参与细胞分裂、细胞计划、囊泡运输和细胞膜重构等生物学过程，在这个过程中由于基因转录物质所含翻译起点和变异等不同，产生了很多个亚型[8-9]。对于Septin9基因来说，N末端的特点是拥有较长的脯氨酸区域，C端午卷曲结构，研究该基因的生物学结构发现，主要借助与中央区域的鸟核苷酸相互作用的序列，和肌动蛋白、微管蛋白等主要的细胞骨架成分之间相互作用，不断衔接实现将其他蛋白募集至细胞质的定位功能[10]。如果Septin9蛋白正常表达受到干扰后细胞就不能完全分裂，会产生双核细胞；细胞基因不稳定后容易向肿瘤转化[11]。有资料显示，血浆甲基化Septin9基因甲基化在结直肠癌患者中的表达明显高于健康人群、也高于其他系统恶性肿瘤和非恶性病变患者，而且在使用亚硫酸盐转化DNA进行10倍稀释后进行检测方式改进后，能够明显的提高结直肠癌的检测率和特异度[12-13]。

本研究中使用的检测试剂盒是在PCR试验方法的基础上进行了几项改进，如减少洗脱液的量提高提取DNA的浓度，去除PCR抑制物、增加引物浓度、降低内参照的浓度、使用不同荧光探针等，从而提高检测的敏感度和特异性[9]。由研究结果可以看出，检测SFRP1和Septin9基因甲基化联合粪隐血免疫胶体金进行检查具有一定的互补性，能够提高检测的敏感度和特异度。本研究的不足之处是没有对进展期的结直肠癌患者SFRP1和Septin9基因甲基化程度进行观察，而且样本数量偏少；再者结直肠癌患者属于高危人群，验前概率偏高，具有转诊偏倚，这个结果是否符合一般风险人群，需要进一步深入研究进行验证。而且在临床实际检查过程中，使用结直肠镜检查的费用偏低，使用试剂盒检查费用昂贵，对于经济条件较差的患者来说需要承担的经济压力比较大[14-15]。

综上所述，SFRP1和Septin9基因甲基化联合粪免疫学检查可提高结直肠癌和癌前病变诊断的敏感度和特异度，而且具有无创、采样简单、依从性强、实验方法稳定等特点，适宜于临床推广使用。