蟾毒灵通过下调PKM2抑制黑色素瘤细胞增殖、迁移与侵袭的实验研究

石 婷，张 雯，周 群，朱余兵

南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）药学部，南京 210006

肿瘤细胞的“瓦伯格效应”与糖酵解途径中关键酶的异常表达密切相关，近年来研究发现，M2 型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）在肿瘤糖酵解及肿瘤转移过程中发挥着至关重要的作用[7-9]。同时也有研究报道，黑色素瘤具有高度活跃的糖酵解进程，且PKM2 呈过表达状态，提示PKM2 可能是抑制黑色素瘤侵袭与转移并能有效治疗黑色素瘤的潜在靶点[10]。

蟾毒灵（bufalin）作为一种甾体类化合物，是中药蟾酥中的主要活性成分，也是蟾酥发挥抗肿瘤的主要活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、强心、调节免疫等生理活性[11，12]。越来越多的研究显示，蟾毒灵对多种肿瘤细胞具有显著的增殖抑制作用[13]，然而关于蟾毒灵对黑色素瘤增殖、侵袭及其相关机制的研究尚未有明确报道。因此，本研究旨在考察蟾毒灵对黑色素瘤细胞增殖、迁移与侵袭，以及对黑色素瘤细胞糖酵解过程的影响，并对其相关作用机理进行探讨。

1 材 料

1.1 材料与药品、试剂

人源A375 黑色素瘤细胞（中国科学院上海生命科学研究院）。

蟾毒灵（纯度＞95%，上海安耐吉化学有限公司）；乳酸测试盒（南京建成生物工程研究所）；丙酮酸激酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；葡萄糖测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）；丝氨酸（上海阿拉丁生化科技有限公司）。

Western blot 所涉及抗体：GAPDH（Bioworld 公司）；PKM2（SAB 公司）；MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin（CST 公司）。

Transwell 小室（美国Corning 公司）。

1.2 仪器与设备

二氧化碳培养箱（型号311，Thermo Fisher Scientific）；酶标仪（型号Synergy2，美国Bio Tek）；凝胶成像系统（型号GelDoc 2000，美国Bio-Rad）。

2 实验方法

2.1 蟾毒灵对A375 细胞增殖的影响

A375 细胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培养基、在培养条件为37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养。取对数生长期的细胞，用胰酶消化后离心，重悬细胞后计数，调整细胞浓度为4×104个/mL，接种于96 孔板中，每孔200 μL 细胞悬液，培养过夜，待细胞增长至约75%左右时，分别加入不同浓度的蟾 毒灵（1、2、4、8、16、32、64、128 nmol·L-1）以 及 对照溶剂，孵育24 h 后吸弃上清液，每孔加入MTT 100μL 继续培养4h 后吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO 振荡10 min，在490nm 波长下测定吸光度值（A）。

图4所示为氯气物质的量分数为0.02%的氮气体系中氯气的吸附穿透曲线（吸附压力为0.3 MPa，氮气流量为25 mL/min，室温）。分析可知，两种活性炭基脱氯剂均具备微量氯深度净化性能，均能将氯含量脱除至物质的量分数小于0.00002%。但相比而言，CT-01I具备更优的微量氯深度净化性能，其氯穿透时间为61.3 min，远优于AC-101的44.6 min。

细胞增殖活力（%）=（1－A实验组/A溶剂对照组）×100%。重复3 次。

2.2 蟾毒灵对A375 细胞乳酸分泌和葡萄糖消耗的影响

将A375 细胞接种于6 孔板中，每孔2 mL，细胞浓度为7.5×104个/mL，待细胞贴壁生长至约70%后，吸弃上清液，PBS 荡洗一次，加入含不同浓度的蟾毒灵，并设定溶剂对照组，继续培养24 h 后收集培养上清液，同时用胰酶消化细胞，计数每孔细胞数，根据检测试剂盒的操作说明测定乳酸、葡萄糖含量，以每105个细胞分泌的乳酸、消耗的葡萄糖作为结果分析。

2.3 蟾毒灵对A375 细胞丙酮酸激酶活力的影响

将A375 细胞接种于6 孔板中，每孔2 mL，细胞浓度为7.5×104个/mL，待细胞贴壁生长至约70%后，吸弃上清液液，PBS 荡洗一次，加入含不同浓度的蟾毒灵，并设定溶剂对照组，继续培养24 h 后胰酶消化细胞，用细胞裂解液裂解细胞，离心后取上清液，测定上清液蛋白含量，依据试剂盒操作说明检测蛋白上清液中丙酮酸激酶的活力。

2.4 蟾毒灵对A375 细胞迁移与侵袭的影响

划痕实验：将A375 细胞接种于6 孔板中，每孔2 mL，细胞浓度为2×105个/mL，待细胞贴壁生长至80%～90%，吸弃上清液，PBS 荡洗一次，用10 μL 枪头沿孔的中线垂直划痕，PBS 荡洗两次后，加入含不同药物的无血清培养基，分别设4 个组：溶剂对照组、丝氨酸组（Serine，1 mmol·L-1）、蟾毒灵组（8 nmol·L-1）、丝氨酸（1 mmol·L-1）+蟾毒灵（8 nmol·L-1）组。于0 h、24 h 分别在倒置显微镜下拍照。

Transwell 侵袭实验：待细胞处于对数生长期，提前一天用无血清培养基培养过夜，次日胰酶消化后重悬细胞。在transwell 小室（24 孔板）内铺上50 μL的基质胶，在24 孔板中加入含15%的胎牛血清培养基，上室中加入含不同药物的用无血清培养基重悬的细胞悬液100 μL（1×106个/mL），分别设4 个组：分组同“2.4”该节划痕试验。在培养箱中继续培养24 h 后取出小室，PBS 荡洗后用棉签擦去小室内多余的细胞，用4%多聚甲醛固定15 min，晾干，利用0.5%结晶紫染色15 min，PBS 荡洗3 次，于倒置显微镜下拍照，计算穿膜后在膜底部贴壁的细胞数量。

2.5 免疫印迹实验检测蟾毒灵对PKM2 及肿瘤转移相关蛋白的影响

将A375 细胞接种于6 孔板中，每孔2 mL，细胞浓度为2×105个/mL，待细胞贴壁生长至约70%后，吸弃上清液，PBS 荡洗一次，加入含不同浓度的蟾毒灵，并设定溶剂对照组，继续培养24 h，以胰酶消化细胞，用细胞裂解液裂解细胞，离心后取上清液，检测上清液蛋白含量，确定蛋白上样量。通过SDS-PAGE凝胶电泳后，将凝胶中的蛋白通过湿转至PVDF 膜上。利用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST 洗膜5次，每次10 min。然后加入对应的一抗孵育，4 ℃过夜，回收一抗，用TBST 洗膜5 次，每次10 min。室温孵育二抗2 h，TBST 洗膜5 次，每次10 min。使用ECL 发光液显色，凝胶成像系统成像。

2.6 统计分析

3 结果

3.1 蟾毒灵对黑色素瘤A375 细胞增殖的影响

为了确定蟾毒灵对黑色素瘤细胞A375 增殖的影响，利用MTT 实验考察了蟾毒灵干预细胞后对细胞增殖能力的影响。结果显示，蟾毒灵能够有效抑制A375 细胞的增殖活力，当干预时间为24 h，蟾毒灵在浓度为16 nmol·L-1时就能显著抑制A375 细胞的增殖，并呈剂量依赖性和时间依赖性。见图1。为了排除细胞增殖对蟾毒灵干预细胞的影响，后续实验采用的蟾毒灵浓度为1、2、4、8 nmol·L-1。

3.2 蟾毒灵对A375 细胞乳酸生成、糖耗量及丙酮酸激酶的影响

图1 蟾毒灵对A375 细胞增殖的影响（n=3）

多数肿瘤细胞即使在氧气条件充足的情况下，仍然选择有氧糖酵解作为主要功能方式，其主要特征是葡萄糖消耗增加以及乳酸生成增多[5，6]。为了考察蟾毒灵是否对A375 细胞有氧糖酵解有抑制作用，首先考察了蟾毒灵对A375 黑色素瘤细胞乳酸生成及糖耗量的影响。如图2-A 和图2-B 所示，蟾毒灵能够剂量依赖性的抑制A375 细胞的乳酸生成量和葡萄糖消耗量。其次，继续考察了蟾毒灵对糖酵解中关键激酶—丙酮酸激酶的影响。如图2-C 所示，蟾毒灵干预A375 细胞后，显著抑制了A375 细胞内丙酮酸激酶的活力，表明蟾毒灵可能通过抑制丙酮酸激酶，进而下调了A375 细胞内的糖酵解水平，抑制A375 细胞的增殖。

3.3 蟾毒灵对A375 细胞迁移与侵袭的影响

图2 蟾毒灵对A375 细胞糖酵解和丙酮酸激酶的影响

有研究显示，肿瘤细胞的糖酵解进程与肿瘤迁移、侵袭密切相关，过度活化的糖酵解进程能够促进肿瘤细胞的迁移与侵袭[6]。因此进一步考察了蟾毒灵对A375 细胞迁移与侵袭的影响，并利用PKM2的激动剂干预，探讨了PKM2 在蟾毒灵对A375 细胞迁移与侵袭过程的作用。如图3-A 所示，在划痕实验中，蟾毒灵干预A375 细胞后显著抑制了A375细胞的水平迁移能力；而PKM2 激动剂丝氨酸促进了A375 的迁移，当蟾毒灵与丝氨酸共同干预后，丝氨酸的促迁移作用被显著逆转。在transwell 小室实验中也得到了相一致的结果（见图3-B）。这些结果表明，蟾毒灵抑制A375 细胞的迁移与侵袭能力与下调PKM2 相关。

图3 蟾毒灵对A375 细胞迁移与侵袭的影响（n=6）

3.4 蟾毒灵对A375 细胞中PKM2 及肿瘤转移相关蛋白表达的影响

有报道关于，PKM2 的过表达能够促进肿瘤细胞的增殖与侵袭，并且能够调控肿瘤侵袭相关蛋白的表达[8，9]。为了进一步明确蟾毒灵对A375 细胞增殖与侵袭的抑制作用与PKM2 的相关性，考察了蟾毒灵对PKM2 及肿瘤转移相关蛋白表达的影响。Western blot 结果显示，蟾毒灵能抑制A375 细胞中PKM2 的蛋白表达（见图4-A）；并且能下调促进肿瘤侵袭相关蛋白MMP2、MMP9 和N-cadherin 的表达，上调抑制肿瘤侵袭相关蛋白E-cadherin 的表达（见图4-B）。以上结果提示，蟾毒灵对A375 细胞增殖、侵袭的抑制作用与其下调细胞内糖酵解进程和PKM2 的表达相关。

图4 蟾毒灵对A375 细胞中PKM2 及相关蛋白表达的影响（n=3）

4 讨论

现代研究表明，肿瘤细胞的有氧糖酵解促进了肿瘤的增殖与侵袭，其中糖酵解过程中的关键限速酶-PKM2 的高表达，是肿瘤细胞有氧糖酵解高度活跃的关键调控蛋白之一[14]。近年来，越来越多的研究发现，PKM2 的高表达促进了肿瘤的增殖与侵袭[15，16]，提示过度表达的PKM2 有可能通过加速肿瘤细胞的有氧糖酵解，进而促进了肿瘤细胞的增殖与侵袭。

本实验结果表明蟾毒灵能显著抑制A375 黑色素瘤细胞的增殖能力；而在对细胞增殖没有显著影响的剂量下，蟾毒灵能抑制A375 细胞的有氧糖酵解及丙酮酸激酶的活力，并能显著抑制A375 的迁移与侵袭。进一步研究发现，在加入PKM2 激动剂丝氨酸[17]的条件下，蟾毒灵能逆转丝氨酸对A375细胞迁移与侵袭的促进效应。有研究显示，肿瘤细胞中的PKM2 能调控多种与肿瘤侵袭的相关蛋白，包括MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin[18]，其中MMP-2、MMP-9、N-cadherin 的过表达与E-cadherin 的低表达，能促进肿瘤的转移与侵袭。在本研究中发现，蟾毒灵能剂量依赖性的抑制PKM2 的蛋白表达，同时对MMP-2、MMP-9、N-cadherin 也有显著的抑制效应，对于E-cadherin 具有促进作用。

综上所述，本研究表明，蟾毒灵可能通过抑制A375 黑色素瘤细胞有氧糖酵解过程中的关键酶PKM2，进而下调MMP-2、MMP-9、N-cadherin 的表达，并上调了E-cadherin 的表达，从而抑制了A375黑色素瘤细胞的增殖、迁移与侵袭。

本研究初步探讨了蟾毒灵对A375 黑色素瘤细胞有氧糖酵解过程中的关键酶PKM2 的影响，提示通过抑制肿瘤细胞中PKM2 的表达可以成为抑制肿瘤细胞增殖与侵袭的一种途径，为研发靶向PKM2 的抗肿瘤药物提供了一个新的思路。