多次应用氟西汀对苯环己哌啶诱导的青年大鼠自主运动增多行为的长期影响*

束 庆，严思敏，姚 瑶，葛卫红，李 鸣

1南京大学医学院附属鼓楼医院 药学部，南京 210008；2 内布拉斯加州-林肯大学 心理系，美国 68588-0308

氟西汀（fluoxetine，FLX）是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI），临床上用于抑郁症、强迫症及精神分裂症伴有抑郁、强迫、欣快感缺失等症状的治疗。2006年FLX 被批准用于8 岁以上儿童轻、中度抑郁症的治疗，该药用于青少年患者的治疗正日益增加[1]。但是，研究提示FLX 会增加儿童和青少年的自杀倾向和攻击行为，SSRI 会对青少年的神经系统的发育产生影响[2]。本研究者前期的研究发现，大鼠在青少年时期暴露于抗精神分裂症药物奥氮平（olanzapine，OLZ）、氯氮平（clozapine，CLZ）[3]、利培酮（risperidone，RIS）[4]和阿塞那平（asenapine，ASE）[5]后，会影响大鼠成年后再次暴露于这些药物时产生的反应行为。因此，本研究拟考察大鼠青年时期使用FLX 对大鼠成年后行为的长期影响。目前，关于青年时期暴露于FLX 的研究多集中于母性剥夺应激[6]或者是宫内缺氧等模型[7]，未见关于苯环己哌啶（phencyclidine，PCP）诱导的自主运动（locomotor activity，LA）增多的青年大鼠模型中的研究。此类研究的结果多涉及治疗效果[8]或不良反应[9]，关于药物引起动物行为改变的长期影响的研究却甚少。

PCP 能使正常人产生拟精神病症状和加重精神分裂症患者的某些精神症状。而对大鼠则会诱导产生LA 过多、认知和感觉的异常，以及社会交往的退缩行为等，这都模拟了临床患者精神分裂症的行为表现。抗精神分裂症药物如CLZ、OLZ、ASE 等可以有效地改善PCP 模型的行为表现[3，5]。此外，PCP还可诱导大鼠在一些学习和记忆测试中表现出感觉门控（sensory gating，SG）功能障碍[10]。SG 是大脑的加工和处理信息的一种正常功能和对感觉刺激反应的调节能力。研究提示，精神疾病患者SG 功能存在障碍，即过滤无关刺激、保护有用信息这一处理过程发生损伤[11]。前脉冲抑制（prepulse inhibition，PPI）测试是考察SG 通道功能的一种有效检测方式。Graham 提出“过程保护”（protection-of-processing）理论来解释PPI：即较强的惊跳刺激之前、给予一个较弱的惊跳刺激不仅启动信息的处理过程，而且是SG 防止干扰信息进入的一种自我保护机制[12]。PCP 会导致SG 受损，而抗精神分裂症药物对SG 受损导致的PPI 下降有改善作用[13]。PPI 是精神疾病诊断和治疗的生物标记物和内表型指标[14]。

本研究应用PCP 建立精神分裂症大鼠模型，在大鼠青年时期（第42～46 天）连续5 天给予FLX（5.0 mg·kg-1或10.0 mg·kg-1）。一方面，通过检测大鼠LA 行为来评价FLX 是否具有抗精神分裂症药物的活性；另一方面，待大鼠成年后再次给予大鼠FLX 处理（第76 天和91 天），通过检测LA 指标观察既往在青年时期接受过FLX 处理的大鼠在成年后再次接受FLX 时大鼠LA 行为是否与青年时期未接受过FLX 处理的大鼠在LA 行为上存在差异，由此观察青年时期的FLX 的暴露是否对成年后大鼠产生了长久的影响。最后，在大鼠生长发育的不同时期（第47、66、77、94 天）对大鼠进行PPI 测试，考察FLX 对不同年龄段大鼠SG 功能的影响作用。

1 材 料

1.1 实验动物

青年雄性Sprague-Dawley 大鼠（101～125 g，鼠龄第37 天，Charles River，Portage，MI，USA）。大鼠每两只饲养在一个48.3 cm×26.7 cm×20.3 cm 的透明饲养笼中，实行12 h 循环光照（时间为早6:30 至晚6:30）。室温22 ℃±1 ℃，相对湿度45%～60%，食物和水充足。实验开始前大鼠在动物房喂养5 天以适应新的环境。所有实验均在相同的时间段（07:00～17:00）、相同的地点和环境中进行。饲养条件及实验操作都按照美国内布拉斯加州—林肯大学动物伦理委员会的规定执行。

1.2 药品和试剂

PCP 和FLX 溶于0.9%生理盐水（vehicle，VEH）中。PCP 由美国国家成瘾药物管理机构提供；FLX由美国国家精神健康药物供应组（NIMH）提供。PCP经皮下注射给药，FLX 为腹腔注射给药。所有实验动物都按1.0mL·kg-1分别给予相应药物。FLX5（5.0 mg·kg-1）或FLX10（10.0 mg·kg-1）剂量选择是参考既往的相关研究[15]。PCP 的剂量选定为3.2 mg·kg-1，是基于实验室前期的研究结果[16]；选择这个剂量的PCP不仅可以诱导大鼠增加自主运动而且避免僵直重复行为的产生[17]。

1.3 仪器

1.3.1 大鼠自主运动行为（LA）检测仪器 在一个安静的房间里放置16 个长48.3cm、宽26.7cm、高20.3cm的透明有机玻璃箱，每个箱子的大小与大鼠的饲养笼完全一致，每个测试箱沿离底部3.2 cm 高的纵向位置上装有6 个红外光感应柱，柱间相隔7.8 cm。测试箱与电脑相连，相关软件（Aero apparatus sixbeam locomotor system v1.4，Toronto，Canada）可以记录光柱被打断的次数，从而以光柱被打断次数来反映大鼠在测试箱内的LA 次数。该装置及其原理在以往的研究中有描述[3，4]。24 只大鼠根据鼠尾部编号依次分别放入每个测试箱中，分2 批进行测试。

1.3.2 前脉冲抑制（PPI）检测仪器 用于考察大鼠SG 功能的6 个PPI 测试箱均购自Kinder Scientific公司。每个测试箱长35.56cm、宽27.62cm、高49.53cm，由同一个电脑程序控制，每个箱中顶部装有一个可产生70～120 dB（decible，dB）直径为11 cm 的发音装置，每个箱子均由隔音材料组成，6 个箱子声音互不干扰。在箱子的底部是一个感受压力器，用于测量大鼠在声音刺激下产生的惊跳反射程度。在实验中，大鼠被置于一个可调节高度的长方形透明的有机玻璃制成的小盒中，小盒长19 cm、宽9.8 cm、高14.6 cm，将该小盒与箱子底部的压力感受器连接后进行测试。一个批次可以对6 只大鼠进行测试。该装置及原理在既往的研究中有描述[14]。

2 方 法

2.1 分组及其干预方法

24 只青年大鼠（第42 天）编号后，以随机数字法分成4 组：空白对照组（VEH+VEH）、PCP 造模组（VEH+PCP）、FLX 低剂量组（FLX 5.0 mg·kg-1+PCP）和FLX 高剂量组（FLX 10.0mg·kg-1+PCP），每组6 只。

实验安排见图1：在实验的第1～2 天，青年大鼠（第40～41 天）适应环境和自主运动测试仪器（30min/天）。第3～7 天，每天大鼠根据分组先给予VEH 或FLX（5.0 mg·kg-1或10.0 mg·kg-1）处理，然后立刻放入自主运动检测装置中，30 min 后再根据分组分别给大鼠VEH 或PCP（3.2 mg·kg-1）处理，立刻再将大鼠放入LA 检测装置中继续检测60 min，每天共进行90 min 的测试。连续5 天（第42～46 天）进行以上的给药处理和LA 测试，通过检测LA 指标观察FLX 是否具有抗精神分裂症药物的活性。待大鼠成年后分别于第75、90 天时4 组大鼠在无任何药物处理情况下，放入LA 测试仪器中再次适应环境和测试仪器（30 min/天）。与青年时期分别间隔30 天和45 天（即第76 和91 天）时，成年后的4 组大鼠都再次暴露于FLX（5.0 mg·kg-1）和PCP（3.2 mg·kg-1）处理并进行90 min[给予PCP 前30 min（即给予FLX 后30 min）+给予PCP 后60 min]的LA 测试。通过检测LA 指标，观察既往在青年时期接受过FLX 处理的大鼠、在成年后再次接受FLX 治疗时、大鼠LA 行为是否与青年时期未接受过FLX 处理的大鼠LA 行为存在差异。此外，分别在大鼠生长发育的不同时期（第47、66、77、94 天），所有大鼠在无药物处理情况下进行共4 次的PPI 测试，来评价FLX 是否会对PCP 建立精神分裂症的大鼠的SG 通道功能产生影响，也是观察FLX 是否具有抗精神分裂症药物活性的指标。

图1 实验安排流程图

2.2 数据统计与分析

所有数据皆选用IBM SPSS 软件进行统计分析。数据统计与分析方法参考既往本作者发表的同样实验设计的、关于抗精神分裂症药物的研究[3-5]。实验中大鼠运动次数以均数+标准差（）表示，5 天连续给药测定的结果采用混合设计方差分析（mixdesign ANOVA），结合Post-hoc LSD 进行组间差异的统计学分析。FLX 再激发测试，用当天的结果以单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Post-hoc LSD分析。PPI 测试的结果采用重复测量方差分析（repeat-measure ANOVAs），结合Post-hoc LSD 进行组间差异的统计学分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠青年期间（第42～46 天）给予5 天FLX或PCP 处理后的LA 测试

由图2-A 显示，4 组大鼠连续5 天在给予VEH或FLX 后的30 min 内的平均LA 次数。Two-way ANOVA 显示，组间有统计学差异：F（3，20）=4.410，P=0.016；测试的天数也有统计学差异：F（4，80）=15.485，P＜0.05；测试的天数与组间交互作用无统计学意义：F（12，80）=1.385，P=0.191。Post-hoc LSD 检验显示，空白模型组大鼠的平均LA 次数显著高于其他3 个组（Ps＜0.05）。

由图2-B 显示，4 组大鼠连续5 天在给予VEH或PCP 后的60 min 的平均LA 次数。Two-way ANOVA 显示，组间有统计学差异：F（3，20）=15.356，P＜0.05；测试的天数有统计学差异：F（4，80）=2.823，P=0.030；但测试的天数与组间交互作用无统计学差异：F（12，80）=1.026，P=0.434。Post-hoc LSD 检验显示，空白模型组大鼠LA 次数显著低于VEH+PCP组（P＜0.05），也显著低于FLX5+PCP 组（P＜0.05），以及FLX10+PCP 组（P＜0.05）。但是，VEH+PCP 组大鼠LA 次 数与FLX 两组比较无统计学差异（Ps ＞0.543）。结果表明，FLX 对于PCP 诱导的LA 没有显著抑制或增加作用。

图2 青年大鼠连续5 天药物处理后的LA 次数（n=6/组）

3.2 大鼠在撤药状态下的LA 测试

再适应当天（第75 天）测试结果，由图3-A 显示，在行为学仪器箱中再次熟悉实验环境时测定LA次数（30 min/天），分析后发现组间因素无统计学差异：F（3，20）=2.013，P=0.144。类似的结果也出现在第二次测试中（第90 天），见图3-B，组间效应无统计学差异：F（3，20）=0.228，P=0.876。结果表明，既往FLX 处理的大鼠并未出现对FLX 处理的记忆效应。

3.3 成年大鼠在第76 天再次暴露于FLX 和PCP处理后的LA 测试

图3 撤药状态下再次适应LA 实验装置时大鼠的LA 次数（n=6/组）

在第76 天，给予低剂量的FLX（5.0 mg·kg-1）、测试进行30 min 后的结果如图4-A 所示。单因素方差分析显示，各组之间无统计学差异：F（3，20）=0.984，P=0.420。在给予PCP 后的60 min 测试结果如图4-B 所示，单因素方差分析后发现各组之间的LA 次数有统计学差异：F（3，20）=11.305，P＜0.05。由Post-hoc LSD 检验显示，VEH+VEH 组大鼠的LA次数显著低于其他3 组（Ps＜0.05），但VEH+PCP 组与FLX 2 组大鼠在LA 次数上无统计学差异（Ps＞0.830）。结果表明，FLX 对于PCP 诱导的LA 行为没有显著的抑制或增加作用。

图4 第76 天大鼠再次接受FLX 和PCP 处理后的LA 次数（n=6/组）

3.4 成年大鼠在第91 天再次暴露于FLX 和PCP处理后的LA 测试

在第91 天，给予FLX（5.0 mg·kg-1）后的30 min结果如图5-A 所示，单因素方差分析显示，各组之间无统计学差异：F（3，20）=0.090，P=0.964。而给予PCP 后60 min 的测试中如图5-B 所示，组间有统计学差异：F（3，20）=5.709，P=0.005。由Post-hoc LSD检验显示，空白对照组大鼠的LA 次数显著低于模型组（P＜0.05），也显著低于FLX 两给药组（P＜0.05）。但是模型组与两组FLX 大鼠在LA 次数上相比无统计学差异（Ps＞0.558）。结果表明，FLX 对于PCP 诱导的LA 没有抑制或增加作用。

图5 第91 天大鼠再次暴露于FLX 和PCP 处理后的LA次数（n=6/组）

3.5 大鼠在4 个不同年龄时期进行的PPI 测试

由图6 所示，所有大鼠撤药时4 次的PPI 测试结果，组间均无统计学意义：PPI 第47 天，P=0.342；第66天，P=0.358；第77 天，P=0.857；第94 天，P=0.957。“组×声音分贝”的统计分析也未发现显著差异，4 次的P 值依次为：P=0.198、P=0.773、P=0.581、P=0.426。

图6 大鼠在4 个不同年龄时期进行的PPI 测试（n=6/组）

4 讨论

人体在青少年到成年这一期间，中枢神经系统的发育，特别是在前额皮层、纹状体、海马的多巴胺和5-羟色胺这两个神经递质系统突触的连接、受体的密度，经历了非常巨大的变化[1]。因此，青少年时期使用FLX 有可能使得神经系统在发育和成熟进程中受到影响，也会改变成年后对药物的反应。本研究应用PCP 建立精神分裂症大鼠模型，在大鼠青年时期连续5 天给予FLX（5.0 mg·kg-1和10.0 mg·kg-1）处理后，通过检测大鼠LA 行为变化，来评价FLX 是否具有抗精神分裂症药物的活性。待大鼠成年后（第76、91 天）再次给予大鼠FLX（5.0 mg·kg-1）处理，观察青年时期FLX 的使用是否对成年后的LA 行为产生影响。此外，在大鼠生长发育的不同时期（第47、66、77、94 天）对大鼠进行PPI 测试，考察药物对大鼠SG 功能的作用。研究结果显示，FLX 5.0mg·kg-1或10.0 mg·kg-1在5 天的给药后都没有抑制或增强PCP 诱导的LA 增多的作用，青年时期给予大鼠FLX处理没有对大鼠成年后再次接触FLX 时的LA 行为产生影响，FLX 没有对大鼠中枢的SG 通道功能产生影响。抗抑郁药FLX 在由PCP 建立的大鼠LA行为增多模型中未显示出抗精神分裂症的药理作用。

研究表明，急性给予大鼠抗抑郁药物如氟西汀、西酞普兰对PCP 诱导的运动增多无抑制效果，但反复给予大鼠抗抑郁药FLX、西酞普兰则会对PCP 诱导的运动增多有增强的趋势[15]。本实验中FLX 对PCP 的效应未显示出增强效应，可能原因在于：本实验给予FLX 的方式是腹腔注射而不是口服，PCP 给予的剂量是3.2 mg·kg-1而不是10.0 mg·kg-1；另外也可能是给药范式所导致的，本实验中是在给予FLX 后的30 min 即皮下注射PCP，而文献中的PCP 是在口服给予FLX 后的90 min。此外，作者前期利用该动物模型使用与本研究同样的实验范式考察青年大鼠接受抗精神分裂症药物OLZ、RIS[4]对成年后大鼠LA 行为和PPI 的影响。研究结果显示，青年大鼠分别接受5 天的OLZ、RIS 处理后，这些药物有显著抑制了PCP 诱导的LA 增多行为。待大鼠成年后，青少年时期接受过OLZ 处理的大鼠，在成年时期再次接受OLZ 处理时的LA 次数显著低于未接受过OLZ 的两组大鼠（VEH+VEH，VEH+PCP）。OLZ 增敏在诱导阶段的5 天连续给药后的40 天仍然存在，且这个效应是剂量依赖性的。RIS的结果与OLZ 的类似，这提示RIS 和OLZ 都有着类似的受体的阻断作用[3，4]。但是，抗抑郁药物FLX在连续5 天的给药阶段没有表现出抑制LA 的药理作用，说明FLX 在PCP 建立的大鼠模型中未显示出抗精神分裂症药的药理作用。

既往有关PCP 损伤大鼠SG 通道的研究多是在急性给予PCP 时进行的PPI 检测[18]，而不同于本实验中进行的测试皆是在慢性使用PCP 后（即长期给予PCP 后大鼠在撤药状态下进行的检测，如撤药一天后等条件下）。这可能是本实验中并未检测到大鼠的SG 通道受到药物处理的异常改变的原因之一。此外，也有研究提出，慢性长期的给予PCP 引起的大脑神经化学效应的改变与其对行为的影响可能并不是同步出现的[19]。

有关FLX 对于SG 的作用，在本研究中并未观察到FLX 对PPI 的影响。类似本研究的报道有：在大鼠第33～53 天给予FLX（3.0 或10.0 mg·kg-1），然后在60 天后测定PPI，结果表明，FLX 未显著影响大鼠PPI 功能[20]。另一篇研究表明，在大鼠出生的第25～46 天给予青年大鼠FLX（12.0 mg·kg-1），未见PPI 受到FLX 治疗的影响[21]。此外，有研究通过饮水（0 或120.0 mg·L-1）的方式给予8～12 周的小鼠每天FLX（0 或15 mg·kg-1），在给药后7 天或28 天后均未见FLX 显著影响小鼠的PPI 功能[22]。而在给怀孕小鼠使用FLX，观察其子代小鼠也未见FLX 对子代小鼠的PPI 功能与未接受FLX 处理的子代小鼠的PPI 功能有统计学差异[6]。值得关注的是，有一篇在小鼠青年时期每天分别给予FLX（3.0、15.0、20.0 mg·kg-1）处理后，观察到FLX 有效地改善了PolyIC 造模的感染神经发育缺陷模型小鼠子代的PPI 缺陷。但是对于正常小鼠的后代，在青年时期使用FLX，仍然未见有显著影响[23]。因此，关于FLX 对SG 的作用还需要进一步在不同精神分裂症动物模型及其神经发育的不同时期进行深入的考察。

基于当今社会越来越多的青少年患者在发育时期会接受抗抑郁症药物的治疗，因此，本研究使用青年大鼠来考察此类药物的长期影响的实验范式对临床开展此类研究具有参考意义。未来还需要关注青年时期使用抗抑郁药物对成年后大脑发育或行为的影响，来更好地阐明抗抑郁药物的长期作用，保障青少年合理、安全使用精神类药物。