日本血吸虫尾蚴不同染色方法的比较研究

赵晋英，向思雨，刘鹏，曾明友

(邵阳学院 1.医学检验学院;2.分子生物学诊断重点实验室，湖南 邵阳，422000)

血吸虫病是一种广泛流行的人兽共患寄生虫病，在我国流行的主要是日本血吸虫。血吸虫生活史包括成虫、虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴及童虫 6 个阶段，尾蚴是日本血吸虫的感染期幼虫，人畜接触了含有血吸虫尾蚴的疫水，尾蚴就会通过皮肤很快钻入体内，寄生在宿主肝门静脉-肠系膜静脉系统生长发育、繁殖、产卵，引起血吸虫病[1]。尾蚴是血吸虫的感染阶段，也是其生命的薄弱环节，若能研制出针对尾蚴的疫苗和预防性杀虫药，直接从尾蚴阶段进行除虫，将会是血吸虫病防治中的重大突破[2]。因此开展血吸虫尾蚴研究，建立通过染色法就能简单判别其生长发育阶段、微细结构和化学组成等信息是当前需要迫切开展的一项基础性工作[3]。本研究用8种不同化学染色剂对日本血吸虫尾蚴进行染色，分析血吸虫尾蚴的形态结构和化学组成，探索血吸虫尾蚴标本理想的染色技术，为血吸虫尾蚴研究提供参考，并为教学提供珍贵的永久性教学资源。

1 材料与方法

1.1 钉螺、试剂及主要仪器

阳性钉螺(见图1A)购自江苏省血吸虫病防治研究所，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色液和瑞氏-姬姆萨染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，尼氏(Nissl)染色液购自上海碧云天生物技术有限公司，台盼蓝、刚果红、茜素红、考马斯亮蓝R250、丽春红等化学染料均购自北京索莱宝科技公司，光学显微镜(日本OLYMPUS-UVO.63XC)、图像采集系统(CellSens standard)。

1.2 染色液的配制

1.2.1 0.4%台盼蓝染液

取0.4 g台盼蓝，用100 mL去离子水溶解。

1.2.2 0.1%茜素红染液(pH 8.3)

取1 g Tris碱加入去离子水100 mL中，加HCL待pH为8.3即可，加入0.1 g的茜素红溶解。

1.2.3 考马斯亮蓝R-250染液

取2.5 g考马斯亮蓝R-250溶于227 mL甲醇中溶解，加46 mL冰醋酸，用蒸馏水补足至500 mL。

1.2.4 丽春红染液

取2 g丽春红和30 g 5-磺基水杨酸，加入30 mL三氯乙酸,去离子水定容到100 mL溶解。

1.2.5 刚果红染色液

刚果红0.5 g,甲醇80 mL,甘油20 mL，溶解。

1.3 方法

1.3.1 尾蚴获取

取阳性钉螺30个，放入100 mL烧杯中，加入50 mL杀菌去氯水，将烧杯置于光照充足的室温下5 h，待血吸虫尾蚴逸出水面后备用。

1.3.2 涂片、固定

用接种环蘸取疫水均匀涂布于洁净的防脱载玻片中央，在显微镜下观察尾蚴数量、存活状态、虫体状态等，在酒精灯上稍加热数秒(注意切勿将尾蚴烤干)，使尾蚴尾部伸直(见图1B)，将玻片放置于玻片板上晾干。将晾干的玻片放置于4%甲醛溶液中固定30 min，取出后晾干备用。

A-肋壳钉螺(标尺1.5 cm)；B-未染色尾蚴(×400，标尺50 μm)图1 尾蚴阳性肋壳钉螺和未染色尾蚴Fig.1 Cercariae-positive ribbed-shell oncomelanias and unstained cercariae

1.3.3 染色

1.3.3.1 HE染色

涂片滴加苏木精染液(Harris)染色5 min，水洗1 min，用1%盐酸酒精分化数秒。自来水冲洗后返蓝15 min，然后水洗1 min。入伊红染液染1 min，95%酒精分化5 s。

1.3.3.2 瑞氏-姬姆萨染色

按照试剂说明书滴加A液0.5 mL于涂片上，染色1 min。再将B液滴加于A液上(滴加量为A液的3倍)，以洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色3 min，水洗1 min。

1.3.3.3 Nissl染液染色

用移液枪吸取尼氏染液0.5 mL于涂片上，染色10 min，流水冲洗1 min。

1.3.3.4 台盼蓝染色

用移液枪吸取台盼蓝染液0.5 mL于涂片上，染色4 min，流水冲洗1 min。

1.3.3.5 考马斯亮蓝染色

用移液枪吸取考马斯亮蓝染液0.5 mL于涂片上，染色10 min，用盐酸酒精分化数秒后，流水冲洗数秒。

1.3.3.6 丽春红染色

用移液枪吸取丽春红染液0.5 mL于涂片上，染色5 min，快速蒸馏水冲洗1 min。

1.3.3.7 茜素红染色

用移液枪吸取茜素红染液0.5 mL于涂片上，染色5 min,快速蒸馏水冲洗1 min。

1.3.3.8 刚果红染液染色

用移液枪吸取刚果红染液于涂片上，染色30 min,流水冲洗，碱性酒精分化数秒后流水冲洗1 min。

1.3.4 脱水、透明、封片

将尾蚴染色玻片依次放入70%、80%、90%、100%乙醇溶液中，每个梯度脱水3～5 min，将玻片放入二甲苯中透明2次，每次5 min。中性树胶封片，待干。

1.3.5 镜检和测量

2 结果

2.1 尾蚴测量结果

尾蚴各部位长度和宽度测量结果见表1。

表1 尾蚴各部位长度和宽度测量Table 1 Length and width of each part of cercariae

2.2 HE染色

HE染色将尾蚴体尾部诸结构显示较为清楚，易于分辨。体部头器、原肠、穿入腺、腹吸盘、生殖器原基、排泄囊等处含大量蓝紫色致密颗粒，口器、腹吸盘蓝紫色颗粒周围呈颜色略深的均一红色，其余部位红色较浅。尾干皮下、中线染有大量规则排列分界清晰的蓝紫色颗粒，尾叉部蓝紫色颗粒略为杂乱，尾部其余部位呈着色均一的浅粉红色。见图2A。

2.3 瑞氏-姬姆萨染色

瑞氏-姬姆萨染色将尾蚴体部头器、穿入腺、腹吸盘、排泄囊等部位染成深蓝色斑块，肠管染成蓝色细线状，体部其余部分呈均一深蓝色。尾干外周皮下及尾叉处染有排列整齐的紫色颗粒，尾干中央为一团排列不规则的蓝色颗粒。见图2B。

2.4 Nissl染色

尾蚴对Nissl染液染色呈不均一蓝染。体部头器、穿入腺(包括前钻腺和后钻腺)、腹吸盘、排泄囊等部位深蓝色颗粒致密，其余部位蓝色颗粒较为弥散，尾干中线两侧排列不规则蓝色深染颗粒，尾部皮下染色颗粒整齐着色较浅，尾叉部分亦有少量蓝染颗粒。见图2C。

2.5 台盼蓝染色

台盼蓝能将尾蚴体部头器、穿入腺、胚细胞、腹吸盘等部位染成深蓝色斑块，体部其余部位和尾部呈浅蓝色颗粒，尾部中线两侧排列不规则蓝色深染颗粒，尾部皮下颗粒较浅。见图2D。

2.6 考马斯亮蓝染色

考马斯亮蓝将整只尾蚴染成基本均一的淡蓝色，虫体外周轮廓边界清晰，体部染色较尾部深，体尾交界处染色略深，尾部隐约可见两条蓝色细线，推测可能为排泄管，但其余结构辨认不清。见图2E。

2.7 丽春红染色

丽春红能将尾蚴体部腹吸盘、穿入腺等处染成较深红色，体尾结合处染色较深，其余部位着色较浅且弥散。尾干及尾叉分布大量排列规则的红色颗粒，尾叉分叉处颗粒较为密集。见图2F。

2.8 茜素红染色

茜素红能将尾蚴体部头器、腹吸盘、穿入腺、肠管等部位染成深粉红色，穿入腺处着色最深，体部其余部位被染成均一粉红色。尾干轮廓清楚，中线两侧排泄管染成粉红色，其余部位着色不明显。见图2G。

2.9 刚果红染液染色

刚果红染液能将尾蚴头器、腹吸盘、生殖器原基、排泄囊、肠管等处染成橘红色，其余部位着色较浅。尾部染色较头部略浅，尾干中线可见染成红色的排泄管，其余部位着色不明显。见图2H。

A-HE染色；B-瑞氏-姬姆萨染色；C-Nissl染色；D-台盼蓝染色；E-考马斯亮蓝染色；F-丽春红染色；G-茜素红染色；H-刚果红染色图2 不同化学染料血吸虫尾蚴染色结果(×400，标尺50 μm)Fig.2 Staining results of Schistosoma cercariae with different chemical dyes

3 讨论

血吸虫尾蚴静止时以腹部朝上、尾部向背部弯曲漂浮在水面,活动时依靠尾部的摆动作以尾部向前的倒退姿势运动[4]。因尾蚴具有向光性，本实验采用灯源照射水中的钉螺，促进尾蚴逸出，可获取数量众多的尾蚴。逸出的尾蚴集中于水面，故直接用接种环蘸取水膜涂在防脱载玻片上，在酒精灯上稍加热数秒，促进尾蚴尾部伸直，晾干后甲醛固定，经后续染色、冲洗、脱水、透明等操作，尾蚴不脱片，形态结构保存完整。

毕晓云等[5]通过砸碎钉螺获取尾蚴，采用电子量微镜研究后发现日本血吸虫尾蚴发育分为五期，第一期(S1)为胚细胞期,第二期(S2)为胚球期，第三期(S3)为尾蚴雏体期，第四期(S4)为成熟前期,第五期(S5)为成熟期。本实验通过自然逸出法获取尾蚴，镜下观察活尾蚴的形态和活动度，对染色尾蚴的体部、尾干、尾叉的长度和宽度进行测量，发现尾部长度大于体部长度，从而确定获取的尾蚴主要集中在成熟期阶段，仅有极少量成熟前期尾蚴。

HE染色是组织学和病理学研究中最常用的染色方法，嗜碱性结构可以被染成蓝紫色，嗜酸性结构被染成红色。鲍沁露等[6]报道单独使用0.5%伊红，将死尾蚴染成淡红色，头器颜色相对较深，活尾蚴不能着色。本实验使用了苏木精和伊红两种染液，相较于单一伊红染色，HE染色能更清楚显示尾蚴诸结构。HE染色结果显示尾蚴体部头器、原肠、穿入腺、腹吸盘、生殖器原基、排泄囊等处含大量蓝紫色致密颗粒，推测此处细胞核密集。口器、腹吸盘蓝紫色颗粒周围呈颜色略深的均一红色胞浆，其余部位红色较浅。尾干皮下、中线两侧染有大量规则排列分界清晰的蓝紫色颗粒，属于肌细胞和排泄管细胞的细胞核，这与毕晓云等[5]描述的一致。

瑞氏-姬姆萨染色是脱落细胞、血液和骨髓细胞染色中常采用的方法，可以将细胞核染成紫色，对胞浆着色力也较强,能较好的显示胞浆的嗜碱性程度[7]。本实验采用瑞氏-姬姆萨染液对尾蚴进行染色，结果发现瑞氏-姬姆萨染液可将尾蚴体部头器、穿入腺、腹吸盘、排泄囊等结构染成深蓝色斑块，这与HE染色中苏木精的着色相似，但体部其余部分呈均一深蓝色。瑞氏-姬姆萨染液可将尾干外周皮下及尾叉处染成排列整齐的紫色颗粒，尾干中央为一团排列不规则的蓝色颗粒，这与HE染色结果相似，但染色整体效果及对比度不及HE染色法更形象和直观。

Nissl染色是神经组织染色中常用方法，染色液中的甲酚紫可将细胞核和神经细胞中的尼氏体染成蓝色[8]。本实验选用含有甲酚紫的Nissl染色液对尾蚴涂片进行染色，结果发现体部头器、穿入腺、腹吸盘、排泄囊等部位含大量深蓝色颗粒，其余部位蓝色颗粒较为弥散。这一结果与HE染色和瑞氏-姬姆萨染色结果相似，说明这些部位细胞密集。尾干中线两侧排列不规则蓝色深染颗粒，皮下整齐排列浅染颗粒，尾叉部分亦有少量蓝色颗粒。尾部结果与HE染色和瑞氏-姬姆萨染色结果略为不同，中线颗粒颜色强于皮下颗粒，推测中线两侧是神经细胞集中区域。

台盼蓝是一种优越的鉴别细胞活性的染料，本实验中用4%台盼蓝经5 min 染色后，不能使活尾蚴着色，但能将死尾蚴体部头器、穿入腺、胚细胞、腹吸盘等部位染成深蓝色，体部其余部位和尾部呈浅蓝色，轮廓清晰，还可将尾部中线两侧染出排列不规则蓝色深染颗粒，尾部皮下颗粒整齐浅染，这与本实验Nissl染色的结果相似。

考马斯亮蓝R-250和丽春红均可与蛋白质结合。考马斯亮蓝可与蛋白质结合显现蓝色[9]。丽春红可以蛋白质结合显现红色[10]。经染色后尾蚴体部较尾部着色深，这说明尾蚴体部的蛋白质含量比尾部高。尤其腹吸盘、体尾交界处着色最深，推测这两个部位蛋白含量较其他部位高。但两种染料对尾蚴体部内部结构均显示欠佳。两种染料对尾部的染色明显不同，考马斯亮蓝可使尾部隐约可见两条蓝色细线，推测其为排泄管，但其余结构辨认不清。丽春红能将尾干及尾叉染出大量排列规则的红色颗粒，颗粒形态与HE和瑞氏-姬姆萨染色颗粒形态类似，推测可能属于同一种结构。

茜素红能与碳酸钙或磷酸钙等钙盐螯合形成橙红色复合物，适用于少量钙盐沉着组织的染色[11]。在本实验中茜素红能将尾蚴体部头器、腹吸盘、穿入腺等部位染成深粉红色，其余部位被染成浅粉红色，推测染色深的部位可能有更多钙盐沉积。尾干中线可见染成红色的排泄管，其余部位着色不明显。

刚果红染色常用于组织切片中淀粉样物质的染色[12]。本实验发现刚果红能将尾蚴头器、腹吸盘、生殖器原基、排泄囊等处染成橘红色，其余部位着色较浅。尾干皮下及中线两侧可见规律排列的橘红色染色颗粒，与上述几种染料颗粒形态相同。

总之，组织细胞的化学染色是使染料透入被染物,并被收留于其内部的一种过程,此过程既有物理的吸附作用，又有化学结合作用，细胞的成份和化学性质不同，对各种染料的亲和力也不同[7]，因此在同一涂片可见不同的着色效果。本实验采用了8种不同的化学染料对尾蚴进行染色，8种染色方法均能使尾蚴呈不同程度的着色，但在尾蚴形态结构显示上有差异。本实验不同染料对尾蚴染色结果的差异性可能与染料与被染组分的特异性结合如酸碱化学反应有关，也可能存在非特异性结合。其中HE染色能将尾蚴各部位器官显示清楚，对比明显，可在教学科研中广泛使用，其余染色方法着色组分各有特色，应根据研究目的不同，选取不同的染色方法。