龙牙百合总黄酮的索氏提取工艺正交优化及抗氧化性研究

傅春燕，罗聪，龙佳欣，汤俊颖，胡悦，张亚兰

(邵阳学院 药学院，湖南 邵阳,422000)

龙牙百合(Liliumbrowniivar.viridulum)为百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生宿根草本植物。湖南邵阳每年种植龙牙百合面积约为4×106m2，年净产约3×106kg，产值高达1.05亿元，已成为当地的特色产业[1]。百合味甘，性寒，归心、肺经，养阴润肺，清心安神，用于阴虚燥咳，劳咳嗽血，虚烦惊悸，失眠多梦，精神恍惚[2]。百合鳞茎含有丰富的皂苷[3]、黄酮[4]、多糖[5]、酚类化合物[6]等活性化学成分。现代药理研究表明，百合具有止咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗疲劳、降血糖、抗肿瘤、抗抑郁等活性[7-9]。黄酮类化合物(flavonoids)是一类含有2-苯基色原酮结构的天然化合物，具有非常强大的抗氧化和清除活性氧的能力,可以防止自由基攻击DNA而诱导细胞癌变，在心血管系统、内分泌系统、免疫系统和抗肿瘤等多方面具有显著的药理活性[10],在食品、医药、保健品等领域具有广阔的发展前景[11]。本研究以湖南特产龙牙百合为原料，采用索氏提取方法，通过单因素水平实验和正交实验研究了龙牙百合总黄酮的最佳提取工艺和含量测定，并与维生素C作对比进行清除自由基能力的抗氧化性实验，旨在为进一步开发利用龙牙百合总黄酮提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将新鲜的龙牙百合鳞茎(购于湖南省邵阳百合种植基地)放置60 ℃恒温箱中烘干，粉碎，过60目筛，密封冷藏，备用。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等化学药品均为分析纯；芦丁标准品(批号：100080-200707)，纯度≥98%(中国食品药品检定研究院)。

1.2 主要仪器

主要仪器见表1。

表1 主要仪器Table 1 Main instruments

1.3 实验方法

1.3.1 样品溶液的制备

准确取20 g龙牙百合鳞茎粉，用滤纸卷好置于250 mL索氏提取器中，按料液比为20∶100 g/mL加入浓度为75%乙醇100 mL，提取时间90 min，提取液经旋转蒸发仪浓缩，残渣加70%乙醇溶解，定容至50 mL，备用。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线的绘制步骤及过程见图1。

图1 芦丁标准曲线的绘制步骤及过程Fig.1 Drawing procedure and process of rutin standard curve

1.3.3 龙牙百合总黄酮含量测定

取上述待测样品溶液4.00 mL，置于 25 mL容量瓶中，按1.3.2方法，静置15 min后,在510 nm波长下测定吸光度A，根据回归方程计算待测溶液中的龙牙百合总黄酮的含量(mg/mL)，换算出样品中总黄酮的含量(mg/g)。

1.3.4 总黄酮提取率的计算

总黄酮提取率(%)=(提取液中总黄酮质量/ 百合粉末量)×100%。

1.3.5 显色稳定性实验

精密吸取对照品溶液和稀释后的供试样品，分别按“1.3.2”的方法对样品显色后，分别放置0、8、15、30、60 min，紫外分光光度法测定样品总黄酮的吸光度，考察样品显色后的稳定性。

1.3.6 提取方法的筛选

在乙醇浓度为75%，料液比为20∶80 g/mL、提取时间为30 min的条件下分别采用微波提取法、超声波提取法、索氏提取法和加热回流提取法四种方法进行提取，对得到的总黄酮分别用分光光度法测定其含量，筛选出最佳的提取方法。

1.3.7 单因素水平实验

(1)提取时间的筛选：在乙醇浓度为75%，料液比为20∶80 g/mL的条件下，分别比较不同提取时间(30、60、90、120、150 min)对龙牙百合鳞茎总黄酮提取率的影响。(2)料液比的筛选：在乙醇浓度为75%，提取时间为120 min的条件下，分别比较不同料液比(20∶80、20∶100、20∶150、20∶200、20∶250 g/mL)对龙牙百合鳞茎总黄酮提取率的影响。(3)乙醇浓度的筛选：在料液比为20∶200 g/mL，提取时间为120 min条件下，分别比较不同乙醇浓度(55%、65%、75%、85%、95%)对龙牙百合鳞茎总黄酮提取率的影响。

1.3.8 正交实验

根据单因素实验结果，确定提取时间(A)、料液比(B)、乙醇浓度(C)为考察因素，采用 L9(34)正交表安排实验，因素水平设计见表2，以总黄酮提取率为指标，确定龙牙百合鳞茎的最佳提取工艺。

表2 正交实验的因素及水平Table 2 Factor and level of orthogonal experiment

1.3.9 方法重现性试验

根据正交实验得出结果，同时做6个平行样品，计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.3.10 抗氧化活性研究

按照本课题组报道过的抗氧化性活性的研究方法[12]，采用最优提取方法提取龙牙百合鳞茎总黄酮，将提取出的黄酮液按比例稀释，浓度分别为1.000、0.500、0.250、 0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL，进行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)抗氧化性试验。取2 mL稀释后的各浓度龙牙百合鳞茎总黄酮提取液及2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液，加入同一具塞试管中，摇匀，在室温下密闭静置30 min，以纯溶剂作参比溶液，于510 nm波长下用分光光度法测定吸光度。根据下列公式计算龙牙百合总黄酮提取液对 DPPH·自由基的清除率[12-13]：

DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

其中Ai为加入 DPPH·试剂后样品溶液的吸光度；Aj为未加入DPPH·试剂时样品溶液的吸光度；Ac为加入 DPPH·试剂后空白对照溶液的吸光度。

对照实验：用同样的方法测定相同浓度维生素C溶液对 DPPH·的清除能力。

1.3.11 数据处理

数据采用 Origin 8.0、SPSS 13.0 软件进行处理并作差异性分析。

2 结果

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出芦丁标准曲线(见图2)，可知该标准曲线方程为y=14.487x-0.004，相关系数R2=0.999 8。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Rutin standard curve

2.2 显色稳定性试验

供试品显色后放置的时间对总黄酮的吸光度的影响如图3所示，随着放置时间的延长，总黄酮的吸光度有一定的影响，在0～15 min内，对照品吸光度的RSD=2.56%(n=6)，样品吸光度RSD=3.25%(n=6)，说明0～15 min内稳定性良好，为最适宜的测定时间。

图3 放置时间对吸光度的影响Fig.3 The effect of placement time on absorbency

2.3 提取方法优化

如图4所示，同一条件时采用微波提取，超声波提取，索氏提取和加热回流提取四种方法进行比较，其中索氏提取法的提取的总黄酮提取率最高，优选索氏提取法进行总黄酮提取工艺研究。

图4 提取方法对总黄酮提取率的影响Fig.4 The effect of extraction method on the extraction rate of total flavonoids

2.4 单因素实验结果

2.4.1 提取时间对总黄酮提取的影响

在乙醇浓度为75%，料液比为20∶80 g/mL的条件下，提取的总黄酮含量随着提取时间的增大而逐渐增加。出于能源和实验时间方面综合考虑，得出龙牙百合总黄酮提取的最佳时间为120 min(见图5)。

图5 提取时间对龙牙百合总黄酮提取的影响Fig.5 Effect of extraction time on total flavonoids extraction from Lilium brownii

2.4.2 料液比对总黄酮提取的影响

在提取乙醇浓度为75%，提取时间120 min的条件下，总黄酮提取率随着温度的升高呈先上升后下降的趋势，当料液比达到20∶200 g/mL时，总黄酮提取率高达约4.20%。故龙牙百合总黄酮提取的最佳料液比应为20∶200 g/mL(见图6)。

图6 料液比对龙牙百合总黄酮提取率的影响Fig.6 Effect of material/liquid ratio on total flavonoids extraction from Lilium brownii

2.4.3 乙醇浓度对总黄酮的影响

如图7所示，在提取料液比为20∶200 g/mL，提取时间120 min的条件下，当乙醇浓度达到75%时，总黄酮的提取率最高，之后随着乙醇浓度的继续增加，总黄酮的提取率显著降低。当乙醇浓度增加后提取液中出现橙色小油滴，这是由于高浓度的乙醇会溶解更多的杂质，从而降低总黄酮的提取率。故提取总黄酮的最佳乙醇浓度为75%。

图7 乙醇浓度对龙牙百合叶总黄酮提取率的影响Fig.7 Effect of ethanol concentration on total flavonoids extraction from Lilium brownii

2.5 正交实验

由正交实验结果表3、4可以得出结论，提取时间(C)对总黄酮提取率的影响在4个因素中最大。通过对比分析，提取时间对总黄酮提取率具有显著性影响(P< 0.01)，其他因素对总黄酮提取率影响差异无统计学意义。

把B合并到D误差项中，形成一个新的误差，初步判断最佳工艺为A2C1。既然B和C都没有统计学意义，且B被合并到误差项，R值越大，极差越大，表明该因素的水平改变对试验结果的影响越大[14]。因此，3个因素对龙牙百合总黄酮提取率的主次影响因素的顺序为：A(提取时间)>C(乙醇浓度)>B(料液比)。考虑到生产成本，以及综合各方面因素确定最佳提取工艺为A2B1C1，即提取时间为90 min，料液比为 20∶100 g/mL，乙醇浓度为75%。

表3 L9(34)正交实验结果Table 3 Results of L9(34)orthogonal experiment

表4 正交实验结果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

注：F0.01(2,4)=18.00，F0.05(2,4)=6.94，P<0.01

2.6 方法重现性实验

根据最优提取方法，用6个平行样品进行验证实验，得出总黄酮提取率为(3.815 ± 0.35)%，相对标准偏差RSD为1.02%。该结果数据显示，提取物总黄酮含量高于所有正交实验结果，这表明本实验研究提取工艺稳定合理，重现性较好。

2.7 比较不同浓度的龙牙百合总黄酮与维生素C的体外抗氧化实验

龙牙百合总黄酮对稳定脂性自由基DPPH·具有清除作用，从图8可以看出，不同浓度的龙牙百合总黄酮和维生素C溶液对DPPH·的清除率均随着浓度的上升而升高，在实验质量浓度范围内呈明显量效关系，龙牙百合鳞茎总黄酮提取液对DPPH·的清除率始终高于相同浓度的维生素C溶液。

图8 龙牙百合总黄酮提取液和维生素C溶液对DPPH·的清除率比较 Fig.8 Comparison of scavenging rate of total flavonoids extract from Lilium brownii and vitamin C solution to DPPH·

3 讨论

本实验以龙牙百合鳞茎为原料，采用索氏提取法提取龙牙百合总黄酮。在单因素实验的水平上，采取正交实验法，确定龙牙百合鳞茎提取总黄酮的最佳工艺。实验结果表明，索氏提取法对龙牙百合总黄酮提取率的3个因素影响为:提取时间>乙醇浓度>料液比。最佳提取条件为：提取时间90 min、料液比为20∶100 g/mL、乙醇浓度75%。在此条件下，得到龙牙百合总黄酮提取率为(3.815 ± 0.35)%。体外抗氧化活性实验结果表明，在相同浓度条件下，龙牙百合总黄酮对DPPH·的清除率与维生素C溶液相比，前者效果更佳，说明龙牙百合总黄酮具有更好的清除DPPH·的能力。

据文献报道，总黄酮的提取方法有热水提取法、加热回流醇提法、超声提取法、微波提取法、超临界提取法、酶解法等[15]。这些方法有些是不适合工业化生产的，例如热水提取法、加热回流醇提法等，虽然提取物中总黄酮的含量较高，但是因为杂质较多造成其纯化程序增加，造成生产成本提高。索氏提取方法是一种常用的、测定结果可靠的经典方法，广泛应用于总黄酮和粗脂肪的提取。索氏提取法利用溶剂回流和虹吸原理，让纯溶剂连续不断萃取固体物质，既节约溶剂同时也提高了萃取效率[16]。根据本实验结果和生产实际，选用更适合工艺生产的索氏提取法进行实验。

该实验采用索氏提取法初步研究了龙牙百合鳞茎总黄酮提取工艺和抗氧化活性，为综合开发和利用湖南本地药食两用中药材——龙牙百合提供理论依据，为深入研究龙牙百合活性成分与药理活性提供参考。