南充地区女性亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性分析

邢晏,冯长焕,杜利君

(1.西华师范大学 数学与信息学院,四川 南充,637000；2.南充市中心医院 医学检验科,四川 南充,637000)

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是细胞内调节叶酸和蛋氨酸代谢的一种重要酶，可催化体内5，10-亚甲基四氢叶酸生成5-甲基四氢叶酸的还原反应，是同型半胱氨酸(Hcy)代谢反应的一种关键酶[1-3]。Hcy水平升高与神经管缺陷、唇腭裂、先天性心脏病等出生缺陷及复发性流产、妊娠期高血压疾病等孕期疾病密切相关，Hcy 水平升高主要是遗传因素和营养因素相互作用的结果[4]。研究表明，母体内发生如流产、早产、死胎、胎儿畸形以及先天性出生缺陷等不良妊娠，Hcy水平增高便是其中的一个高危因素[5-7]。MTHFR有15种点突变类型，其中既常见又重要的为677 C/T基因突变，677 C/T基因突变是第677位碱基C由碱基T取代，包括纯合野生基因型CC、突变基因型TT及杂合基因型CT三大类型。它能使MTHFR酶活性降低及耐热性下降，引起高同型半胱氨酸血症、核酸合成和甲基化异常，使叶酸整体代谢受到影响，进而导致各种疾病发生。叶酸属于B族维生素，人体是无法依靠自身合成的。它是体内极为重要的甲基供体，参与DNA 合成与修复，从而维持人体细胞内正常甲基化及基因组的稳定性。基因多态性会影响体内叶酸及 Hcy 水平，与神经管畸形、复发性流产、妊娠期高血压等疾病发生密切相关，严重影响母婴的健康安全[8]。如果在孕前或怀孕早期开始补充适量叶酸，则神经管缺陷(neural tube defects,NTD)发病率降低70%[9]。可见，人体的叶酸水平与MTHFR多态性密切相关。因此，本文旨在通过对南充地区女性人群进行MTHFR基因多态性分析，为本地女性特别是孕妇人群降低新生儿出生缺陷等循证医学提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取 2014 年1月～ 2018年12月来自南充地区医院检测MTHFR基因多态性的女性患者。检测样本为EDTA抗凝全血，室温放置不超过4 h及未反复冻融，采用泡沫箱加冰袋密封运输。排除样本收集、处理、运送等不符合要求外共收集到有效样本3 980份。样本患者主要来自阆中县、南部县、西充县、蓬安县、营山县、仪陇县及顺庆、高坪、嘉陵市辖三区。年龄14～49岁，平均年龄(28.55±5.45)岁。本研究采取的方法及过程均经本院伦理委员会批准及同意。

1.2 仪器与试剂

仪器：德国Roche(罗氏)公司出产的Roche Applied Science Light Cycler 480荧光PCR仪。

试剂：深圳泰乐德医疗有限公司提供的MTHFR基因 677 C/T 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。其主要组成成分包括R1沉淀液、R2洗液、R3裂解液、R4稳定液、R5 PCR混合液、R6探针及R7、R8阳阴性对照。

1.3 检测方法

PCR-荧光探针法主要步骤：第一步，前准备区试剂预处理。使用时将R1～R4放置室温充分融化，R5～R8置于4 ℃充分融化。第二步，样本处理区样本处理。样本置于室温充分融化。(1)取25 μL样本于1.5 mL离心管内，加入R1 150 μL振荡、混匀，室温放置5 min。再14 000 r/min离心2 min,弃上清，保留沉淀。(2)在上述离心管内加入R2 150 μL振荡至沉淀悬浮，再14 000 r/min离心1 min，弃上清，保留沉淀。(3)加入R3 50 μL振荡至沉淀脱离管底，65 ℃水浴5 min。(4)加入R4 15 μL振荡混匀，离心让溶液集中管底。第三步，试剂配制及样本处理区加样。第四步，PCR扩增区扩增检测。荧光信号的收集定为FAM及VIC，数据采集为60 ℃。

1.4 统计学处理

通过SPSS 19.0 软件进行统计处理。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR C677T 基因多态性分布

在3 980例女性样本中，MTHFR C677T 基因分型中，含突变基因T的CT型与TT型为59.15%，明显高于纯合型CC 40.85%，具体见表1。

表1 南充地区女性MTHFR C677T 基因型分布Table 1 Distribution of MTHFR C677T genotype in female population in Nanchong

2.2 不同年龄组MTHFR基因多态性频率

针对样本研究人群，根据年龄极差分成6组，见表2。总体CT型、CC型百分比较高，TT相对偏低。CC型与年龄无明显差异，而CT型在35岁以上有明显偏低趋势,TT型基本偏低，而且呈现“U”状，降至31～35岁逐渐回升。见图1。

表2 南充地区不同年龄段女性C677T基因分型比率Table 2 Proportion of C677T genotyping in women of different ages in Nanchong

图1 各年龄段基因多态性分布Fig.1 Distribution of gene polymorphisms in all age groups

2.3 不同地区女性 MTHFR基因多态性分布

结合Hardy-Weinberg平衡分析，MTHFR 677 C/T 基因多态性检验结果符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡，样本具有本区域群体代表性。南充地区女性677 C/T 基因多态性与其它几个地区差异情况具体见表3、图2。

表3 不同地区MTHFR基因分型分布情况Table 3 Distribution of MTHFR genotypes in different regions

注：参照童郁等[8]*研究相关内容

图2 各地区基因分型频率Fig.2 genotyping frequency by region

3 讨论

GOYETTE等在1994年将定位于染色体lp36.3的MTHFR基因克隆，随后，引起人们对MTHFR基因多态性研究的广泛兴趣。MTHFR 基因的不同突变类型对其酶活性和热稳定性都会产生不同程度的影响，其中 677 C/T 基因位点突变是MTHFR 基因第5个外显子上发生的一种错义突变[10]。目前，国内外研究最多的就是677 C/T 和 1 298 A/C，677 C/T位点多态性分为CC型、CT型和TT型，与叶酸、Hcy代谢及多种疾病的关系更是近年研究热点。

在3 980例样本女性MTHFR基因分型中，CT型与TT型占59.15%(CT型45.18%，TT型13.97%)，远高于CC型40.85%，可见突变基因T具有明显态势。通过10个不同地区人群分析，发现C677T 基因多态性具有地区差异性。各地区CT型频率基本居高，CC型次之，而TT型最低，其中琼海CC型最高，为61.92%，TT型最低，为6.14%；南充地区女性 MTHFR C677T 基因分型频率与温州、烟台、十堰、武汉、琼海、镇江等地区比较差异有统计学意义(P<0.05)，而与德阳、昆明、吉林等地区比较差异无统计学意义(P<0.05)。就地理位置而言，677 C/T 等位基因频率呈现北方高南方低基本趋势，与童郁等[8]研究结果一致。从样本不同年龄组分析，MTHFR基因分型无明显差异，总体上CC型与CT型偏高，而TT型偏低。MTHFR 677 C/T基因多态性和突变频率在不同国家、不同种族、同一国家的不同地区或不同民族，其分布存在显著差异，这种差异会造成人群对疾病的易感性不同[11]。677 C/T基因多态性与多种类型肿瘤的风险相关[12-13]。因此，女性患者特别是孕妇要高度重视677 C/T 基因多态性检测项目。

ZACHO等[14]分析指出MTHFR 677 C/T 基因多态性可能增加胃癌发病风险。在我国，MTHFR 677 C/T基因多态性与胃癌的发生密切相关[15]。本研究样本中35岁以上女性CT型整体呈下降趋势，但在此年龄段的131例被临床确诊为不同程度的胃病患者高达74例，结果发现CT型相对偏多，年龄越大，胃病越严重，而且TT型患者所占比重偏大。此外，16例TT型患者中有4例为冠心病，其中并伴有不同程度的心脑血管疾病。这与何喜伟等[16]研究结果一致。同时，TT型与患者心脑血管疾病关系也十分密切[17]。在精神内科确诊为认知功能障碍的13例患者中有9例检测为TT型患者，这与FORD等[18]结论相同。

国内外关于MTHFR 677 C/T 基因多态性与高血压的关系报道结果不尽一致，本样本中高血压30岁以上19例(其中CT型6例，TT型2例)，30岁以下2例(CC型1例，CT型1例)，不能体现其强弱关联性。在样本当中，绝大多数来自妇产科孕妇或待孕患者，特别是21～25岁年轻女性人群CT型、TT型所占比例居高(分别为46.3%、14.5%)，结合临床诊断反馈信息，很少有高血压、冠心病、严重胃病及其他高风险相关疾病，主要存在叶酸代谢能力偏低。

MTHFR基因多态性同复发性流产紧密相关，其中基因位点C→T突变可造成孕妇的血Hcy水平上升，胎儿发育障碍，引起流产风险上升，根据临床可通过给予孕妇口服叶酸从而降低流产风险[19]。本地女性在21～35岁年龄段均宜生育，在30～35岁最宜(CC型43.0%，TT型11.7%)，这与医学育龄从20～30岁最佳有一定差异但并不矛盾，因为23～30岁期间女性卵子相对质量较高，胎儿生长发育好，其早产、痴呆儿、畸形儿发生率较低。

由于样本均来自南充地区汉族女性，故没有进行C677T基因多态性的性别分布差异及民族差异分析，以后可进一步丰富资料结合临床进行全面深入探究。

综上所述，南充地区女性人群亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性分布与年龄及地域具有一定的相关性，同样与一些高危疾病也具有风险关联。因此，对于不同地区人群的遗传差异，临床检查与孕保措施要因地制宜、因人而异。进行 MTHFR基因多态性筛查，对突变基因型携带患者进行早期干预，为临床提供一定的诊疗依据，特别是积极预防孕妇妊娠相关疾病具有重要意义。