四川成都郫都地区HBV基因分型及耐药突变分析

王麟，郑敏,胡鹏，胡雪竹，潘跃承，刘翔

(1.成都市郫都区中医医院,四川 成都,611730；2.成都彭州市天恩医院门诊部，四川 成都,611930)

目前全球约有20亿人曾感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中有超过3.5亿人最终成为慢性感染者，每年约有60万人死于慢性或急性乙型肝炎[1]。HBV属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，为部分闭合双链环状DNA，基因组全长约3.2 kb。HBV的基因分型主要根据全基因组核苷酸序列的差异性进行，即HBV全基因核苷酸序列异源性≥8%或者S基因区核苷酸序列异源性≥4%可定为不同的基因型，目前已定义出了A～J 10种基因型，分布在不同地区，存在地域差异[2]。据报道，HBV在复制过程中会产生错误的碱基配对致使核苷酸排列混乱，出现不同的基因型[3]。在长期和不规范用药时由于HBV在Pol/RT区缺乏逆转录酶校正功能，使HBV极易发生基因突变从而产生耐药情况。不同的流行病学特点与病毒的表达方式、致病性与药物的敏感性都有一定的相关性[4]。因此，HBV基因分型和耐药突变位点检测对乙型肝炎抗病毒治疗具有重要的指导意义。但四川西部地区有关这方面的研究资料不多，故本研究对四川成都郫都地区HBV感染者的HBV基因分型和耐药突变位点进行检测、分析，旨在为临床抗病毒治疗HBV感染提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2019年3月来自四川省成都市郫都区中医医院门诊及住院收治的169例慢性HBV感染者，诊断标准采用2010年《慢性乙型肝炎防治指南》。本研究已获得患者知情同意并经本院伦理委员会批准。

1.2 HBV基因分型及耐药基因检测

对每份样本吸取5 μL血清+5 μL DNA裂解液，室温10 min，在CFX Connect Real-Time System仪器上进行DNA扩增，然后再将扩增产物在Pol/RT区进行测序。首先，取产物3 μL+2 μL Exo-SAP酶混合物37 ℃ 60 min、80 ℃ 15 min进行产物裂解，再把聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)酶解产物1 μL+1 μL测序液通过25个循环96 ℃ 1 min、96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min进行PCR测序，最后纯化测序产物(采用醋酸钠-乙醇法)。将扩增后的HBV DNA P基因片段通过碱基序列分析法直接测序后，再利用Chromas软件进行DNA峰形图的查看与编辑，将结果与美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)提供的基因库网页分型工具Genotyping进行比对，该工具可将测序结果与HBV各型参考序列进行比对，并通过比对Pol/RT区变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。

1.3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 21.0软件进行统计处理。HBV不同基因型在性别、年龄、不同突变位点和不同药物间的分布差异采用列联表资料的χ2检验、率和构成比的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV基因型分布特征

2.1.1 169例慢性HBV感染者HBV基因分型

检测结果显示，以B型和C型为主，其二者百分比均高于D型和BC型，差异有统计学意义(P<0.001)，详见表1。

表1 169例慢性HBV感染者HBV基因分型情况Table 1 HBV genotyping in 169 patients with chronic HBV infection

注：基因型B与BC和D组(χ2=112.000，P<0.001),基因型C与BC和D组(χ2=60.000，P<0.001)

2.1.2 HBV基因型在不同性别间及不同年龄间的分布特征

研究结果表明，HBV基因型在不同性别间及不同年龄间的分布差异无统计学意义(χ2=1.103，P=0.776；χ2=12.521，P=0.185)。在不同年龄间的分布以B型为主，构成比>50%；年龄小于20岁的人群中以B型为主，大于20岁的人群中则以B、C型为主，详见表2。

表2 HBV基因型在不同性别间及不同年龄间的分布特征Table 2 Distribution characteristics of HBV genotype among different genders and ages [例(%)]

2.2 HBV基因突变位点分布特征

研究数据显示，四川成都郫都地区HBV患者人群中Pol/RT区耐药位点无突变的例数有86例，占50.9%；发生位点突变的例数有83例，其中单位点突变为40例，占23.7%，双位点突变为29例，占17.1%，三位点突变为12例，占7.1%，四位点突变为2例，占1.2%。研究结果表明，HBV基因型在多重位点突变率比较差异有统计学意义(χ2=55.055，P<0.001)，其中1～2个位点突变者以B型感染为主，构成比>60%，3～4个位点突变者以C型感染为主，构成比分别为58.4%和50.0%,详见表3。

表3 HBV基因突变位点分布特征Table 3 Distribution characteristics of HBV gene mutation sites [例(%)]

2.3 HBV基因突变Pol/RT区耐药突变模式

对169例研究对象中检测出在Pol/RT区发生位点突变的83例突变者进行分析，共检出142个突变位点，其中以在M204I/V、L180M位点的突变为主，分别检出57个突变和30个突变，分别占总突变数的40.1%和21.1%。在15种不同耐药突变模式的检出率上比较差异有统计学意义(χ2=395.568，P<0.001)。其中，Pol/RT区204、180、236、213、207、250、202、215、194位点突变以B型感染为主，构成比≥50%，Pol/RT区181、238、184、173、214、237位点突变以C型感染为主，构成比>53%。其中在B型中检出A194S/T的突变位点1例。详见表4。

表4 HBV基因突变Pol/RT区耐药突变模式Table 4 Drug resistame mutation patterns of HBV gene Pol/RT locus [例(%)]

2.4 HBV基因耐药情况分析

169例HBV感染者中有141例出现耐药(占83.4%)，对这141例患者进行了4种临床常规核苷酸类似物(nuoleotide analogue,NAs)药物检测。研究结果表明，拉米夫定(lamivudine，LAM)耐药为63例，占44.7%；替比夫定(telbivudine，LDT)耐药为53例，占37.6%；阿德福韦(adefovir，ADV)耐药为20例，占14.2%；恩替卡韦(entecavir，ETV)耐药为5例，占3.5%。HBV基因型在这4种抗HBV药物的耐药性差异有统计学意义(χ2=17.250，P=0.045)，其中，LAM耐药比例最高，LDT其次，且均以B型患者为主，占基因型的构成比分别为58.7%和62.3%。详见表5。

表5 HBV基因耐药情况 Table 5 Analysis of HBV genotype resistance [例(%)]

3 讨论

目前，已有很多的研究表明不同基因型HBV感染者的临床表现受病毒多态性、宿主个体差异和环境的共同作用，不同地域、种族、遗传背景下的人群HBV基因型分布不一致，HBV感染者其病程、抗病毒药物的治疗效果及患者的预后都与其所感染的HBV基因型相关[5]。根据各地区的型别分布和流行特点，可推断HBV的传染源和传播途径。我国汉族人群HBV感染者以B型和C型为主，其中南方以B型为主，北方以C型为主，A型和D型在部分地区也存在[6]。本研究对HBV分型采用的碱基序列分析法直接测序，将基因分型的可靠度和可信度大大提高。结果显示，169例四川成都郫都地区HBV感染者当中B型109例，占64.5%；C型57例，占33.7%；D型2例，占1.2%；BC型1例，占0.6%。本地区基因型以B和C型为主，这与有关文献报道结果一致[7]。本研究中检出2例D型，考虑可能为四川成都郫都地区人口流动较大所致。

本研究分析了不同性别及不同年龄段基因分布情况，差异均无统计学意义(P>0.05)。但发现年龄小于20岁的人群中以B型为主，占75.0%；20岁以上的人群中则以B、C型为主。这与有些学者报道B型患者随着年龄增高构成比下降，年龄越大C型构成比越高的结论相一致[8-9]。

本研究表明，Pol/RT区发生突变的HBV感染患者中的基因型在多重位点突变率比较差异有统计学意义(χ2=55.055，P<0.001)，HBV的RT区耐药位点单一位点突变的发生率最高，为23.7%，双位点突变其次，为17.1%，在多位点突变中1～2个位点突变者以B型感染为主，构成比>60%，3～4个位点突变者以C型感染为主，构成比分别为58.4%和50.0%，研究结果提示，B、C型较D和BC型易产生耐药基因突变，这与基因型突变研究的有关文献报道结果一致[10]。

在对HBV基因突变Pol/RT区耐药突变模式检测分析中，共检出142个突变位点，其中以M204I/V、L180M位点的突变为主，分别检出57个、30个突变位点，分别占总突变数的40.1%和21.1%。HBV基因型在检出的15种不同耐药模式的突变率比较差异有统计学意义(χ2=395.568，P<0.001)。其中，Pol/RT区204、180、236、213、207、250、202、215、194位点突变以B型感染为主，构成比均≥50%；Pol/RT区181、238、184、173、214、237位点突变以C型感染为主，构成比均>53%。其中在B型中检出A194S/T的突变位点1例，该位点被认为与富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)的耐药相关。

NAs是治疗乙型病毒性肝炎的主要药物，应用最为普遍[11]。目前临床常用的NAs药物有LAM、ADV、ETV和LDT，它们作用的靶位均在HBV的逆转录酶(reverse transcriptase，RT)基因，但NAs药物长期使用易引起HBV产生耐药突变，使药物治疗的敏感性降低[12]。本研究169例乙肝患者中对4种NAs产生耐药情况分析发现，有83.4%的患者(141/169)会出现一种以上的耐药突变，比国内外HBV的耐药数据(30%～40%)的耐药现状更为严峻[13]。可能是由于HBV病毒Pol/RT区逆转录酶缺乏校正功能，在持久的药物压力下HBV突变率较高。对这141例患者进行4种临床常规NAs药物检测，结果显示，LAM耐药为63例，占44.7%；LDT耐药为53例，占37.6%；ADV耐药为20例，占14.2%；ETV耐药为5例，占3.5%。HBV基因型在这4种抗HBV药物的耐药情况差异有统计学意义(χ2=17.250，P=0.045)，其中，LAM耐药比例最高，LDT其次，且均以B型患者为主，占基因型的构成比分别为58.7%和62.3%。说明在四川成都郫都地区HBV感染者中NAs耐药仍以单一和双重耐药为主，并且以LAM和LDT最为显著。虽然LAM价格低廉、上市早且使用率高，但耐药最高，不宜作为抗病毒治疗的首选药物。

通过对四川郫都地区乙肝病毒HBV感染者的基因分型、耐药突变位点分布和基因耐药情况的分析，为临床对评估乙肝患者是否需要抗病毒治疗和合理用药提供了科学依据。