硅钙微弧氧化涂层钛基体成骨细胞生物相容性的研究

2019-10-30邹智群杨晓宇

中国当代医药 2019年23期

邹智群杨晓宇

[摘要]目的探討不同电压微弧氧化（MAO）处理后含钙硅涂层的钛基体材料成骨细胞的生物相容性。方法纯钛材料进行MAO后（MAO-200 V，MAO-300 V，MAO-400 V）处理制成不同的含钙硅涂层钛材料作为实验组（实验组B、实验组C、实验组D），纯钛作为对照组，每组各15个试件。采用MC3-T3细胞系在实验组和对照组材料上进行培养，用扫描电镜观察细胞的形态，观察细胞在实验组和对照组材料表面的附着和增值情况。结果实验组在应用不同电压处理前后电解液中的钙、磷浓度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。在早期（0.5、1 h）时，实验组B、实验组C、实验组D的细胞黏附率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;2 h后实验组B、实验组C、实验组D的细胞黏附率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），各实验组的细胞黏附率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。随着培养时间的延长，实验组细胞材料表面的OD值均增加（P<0.05）;培养1、4 d时，对照组与实验组的OD值比较，差异无统计学意义（P>0.05）;当细胞培养至7、10 d时，实验组的OD值均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论在不同电压MAO处理后含钙硅涂层的钛材料表面成骨细胞早期附着、形态变化和增殖优于纯钛，具有良好的生物相容性。

[关键词]钛;微弧氧化;成骨细胞;表面处理;生物相容性

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）8（b）-0008-05

[Abstract] Objective To investigate the biocompatibility of osteoblasts of titanium matrix coated with calcium and silicon after microarc oxidation （MAO） at different voltages. Methods After the MAO of pure titanium material （MAO-200 V， MAO-300 V， MAO-400 V） coated with different calcium-containing silicon titanium materials were prepared as the experimental group （experiment group B， experimental group C， experimental group D）， and the pure titanium was used as the control group， with 15 test pieces in each group. The MC3-T3 cell lines were cultured on the experimental group and the control group. The morphology of cells was observed by scanning electron microscopy， and the adhesion and value of cells on the surface of the experimental group and the control group were observed. Results There were no significant differences in the concentration of calcium and phosphorus in the electrolyte before and after application of different voltage treatments in the experimental group （P>0.05）. At the early stage （0.5， 1 h）， the cell adhesion rates of experimental group B， experimental group C and experimental group D were higher than those of the control group， and the differences were statistically significant （P<0.01）. After 2 h， the cell adhesion rates of experimental group B， experimental group C and experimental group D were higher than those of the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The cell adhesion rate of each experimental group was not statistically significant （P>0.05）. With the prolongation of culture time， the OD value of the cells in the experimental group increased （P<0.05）， and the OD values of the control group and the experimental group were not significantly different when cultured for 1 and 4 days （P>0.05）. At 7 and 10 days， the OD values of the experimental group were significantly higher than those of the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Osteoblasts of titanium matrix coated with calcium and silicon after MAO at different voltages have better early attachment， morphological change and proliferation than pure titanium， and have good biocompatibility.

[Key words] Titanium; Microarc oxidation; Osteoblast; Surface treatment; Biocompatibility

国内研究显示，种植体表面进行微弧氧化（MAO）是一种直接在钛表面生长层进行表面处理技术，是在铝、镁、钛及其合金表面通过电解液依靠弧光放电产生的作用与相应电参数的组合，制作出以钛金属氧化物为主要元素的陶瓷层[1-3]。王航等[4-7]研究成骨细胞作为锚和依赖性细胞能够在种植体表面的进行黏附及丛集是种植体获得初期稳定性的重要因素，娄琪等[8-10]研究细胞在材料表面的黏附与伸展受到材料表面性质如表面形貌及表面化学等的影响。本研究采用MAO对钛材料表面进行改性，在电解液中不同电压下加入钙硅元素形成钙硅涂层以增加钛的抗腐蚀能力，对于涂层后钛的生物相容性进行实验研究，以期新的涂层技术使钛能早日成为新型的可降解的医用植入材料应用于临床。

1材料与方法

1.1主要仪器和试剂

1.1.1主要仪器

YZ-2500超净工作台;CO2培养箱;CKX41倒置显微镜;TD25-WS多管架自动平衡离心机;电子天平;37℃水浴箱;扫描电镜;LSM 510 META共聚焦激光扫描生物显微镜;酶联检测仪;冰箱;加样枪;烧杯;三蒸水等。

1.1.2主要试剂

α-MEM培养液;0.25%胰蛋白酶;胎牛血清;双抗;磷酸盐缓冲液;二甲基亚砜（DMSO）;CCK-8;碱性磷酸酶活性测定试剂盒;鬼笔环肽等。

1.1.3金属材料

钛片10 mm×10 mm，厚度1 mm的纯钛片，超声波清洗机。

1.2方法

1.2.1实验分组

将MAO的钛材料按照不同电压合成的方法分为实验组B、实验组C、实验组D及对照组，每组各15个试件。实验组B采用200 V电压处理平板钛，实验组C采用300 V电压处理平板钛，实验组D采用400 V电压处理平板钛，对照组为平板纯钛。

1.2.2实验准备

各实验组全部用大量的去离子水进行反复冲洗，之后经丙酮、无水乙醇超声荡洗10 min后，去离子水再次反复冲洗，进行烘干，湿热法消毒。用扫描电镜观察制作的生物膜表面形态，用衍射图谱（XRD）分析生物膜层的主要成分，用能谱（EDS）分析生物膜层中的钙、硅元素的具体含量。

1.2.3实验过程

1.2.3.1成骨细胞株的传代培养用0.25%胰蛋白酶进行消化5 min左右，观察细胞的具体形态，当细胞呈现圆形，且大部分细胞几乎脱离培养瓶底时，加入培养液（15%胎牛血清，1 μl/ml青霉素、链霉素双抗的DMEM培养基）进行终止消化作用，用胶头滴管吸收消化液进人离心管中，2000 r/min的速率进行离心，5 min后去除离心后的上清液，之后放入完全培养液，形成成骨细胞混悬液，加到3个容量为50 ml的培养瓶中。每个培养瓶中均放入3 ml完全培养液，在37℃的温度下含有5% CO2培养箱中进行成骨细胞传代培养。每天在倒置荧光显微镜下目测原代成骨细胞和传代成骨细胞的生长状态、增殖及形态特征，对生长状态良好的细胞进行镜下拍照。

1.2.3.2细胞黏附实验将第四代细胞接种到三种材料的表面联合培养所有实验组的16个金属件，将成骨细胞以105个/ml的浓度接种于金属件表，置于24孔培养板内，每孔培养板内均填入FBS的α-MEM培养液1.0 ml，置入培养箱中培养。0.5、1、2、4 h后，于各培养板取出其中4个金属件，应用PBS反复漂3次，吸净PBS液体，其中随机将其中1个金属件进行形态学观察，3个试件加入200 μl的培养液与20 μl的CCK-8共同培养4 h后，各孔吸取100 μl置于新的96孔板中，采用酶联免疫检测仪在450 nm处测定吸光度（OD值）。

1.2.3.3细胞形态学观察将试件冷PBS漂洗后，用1.5%戊二醛4℃固定1～2 h。PBS洗3次，10 min/次。再用多聚甲醛固定30 min，用PBS洗3次，10 min/次。乙醇溶液上行脱水（30%、50%、70%、90%、95%、100%）各浓度脱水2次，15 min/次。100%丙酮脱水3次，30 min/次。试件4℃丙酮保存。临界点干燥、喷金、观察与拍照。

1.2.3.4用CCK-8法检测成骨细胞的增殖率所有实验组15枚金属件在24孔培养板内放置，按照105个/ml的浓度把成骨细胞接种于金属件表面，隔3 d换1次液，于1、4、7、10 d后用PBS重洗3遍后，（对照组无细胞）每孔加入含有FBS的α-MEM培养液200 μl，与CCK-8 20 μl共同置入培养箱中培养4 h后，于各孔吸出100 μl，加入新的96孔板中，采用酶联免疫检测仪在450 nm处测定吸光度。细胞增殖率=（ODn-ODo）/ODo，ODn：某检测时间点的OD值，ODo：对照組的OD值。

1.2.3.5钛片表面成骨细胞骨架的形态学观察按照40 000/孔的密度接种细胞，6 h拿出其中一组标本用PBS反复冲洗3次，之后应用2%多聚甲醛进行固定，20 min后再用0.2% TritonX100在常规室温下进行成骨细胞处理，15 min后用含1%牛血清白蛋白的PBS反复冲洗标本，20 min后再用PBS反复冲洗3次。最后将标本放到其他的24孔板中，室温下将300 μl FITC标记的phalloidin放入24孔板中，60 min后用蒸馏水反复冲洗、甘油封片，激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察标本。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，不符合正态分布者转换为正态分布后行统计学分析，多组间进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 MAO改性后的形貌结构特征

不同电压下材料表面出现无数细小、涌动放电的弧光，处理后的材料表面是薄薄的白垩色陶瓷膜。扫描电镜下材料形成的生物膜呈均匀多孔的粗糙面，微孔直径为0.5～2 μm。随电压不断升高，镜下可见微孔的直径不断增大（图1）。实验组材料的EDS分析结果显示，生物膜由钛（Ti）、钙（Ca）、硅（Si）、钠（Na）四种基本元素组成。在应用不同电压处理前后电解液中的钙、磷浓度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。XRD分析结果显示，生成的生物薄膜结晶度高，其中以锐钛矿相TiO2及少量金红石相TiO2为主，还包含少量的非晶相组分（图2，封四）。

2.2各组不同时间点附着情况及细胞形态的比较

在早期（0.5、1 h）时，实验组B、实验组C、实验组D的细胞黏附率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;2 h后实验组B、实验组C、实验组D的细胞黏附率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），各实验组的细胞黏附率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。各组内，随着时间的延长，细胞黏附率逐渐递增（P<0.05）（表1）。

扫描电镜下观察，对照组纯钛表面成骨细胞呈球形，细胞机械贴附在纯钛表面，这种黏附不稳定，易脱落（图3A）;实验组（不同电压处理）的材料表面，细胞呈扁平状，多数进行不规则并有较多突起的伸展，细胞已形成生物学黏附，此黏附比较牢固（图3B～D）。

2.3各组成骨细胞不同时间点增殖情况的比较

随着培养时间的延长，实验组细胞材料表面的OD值均增加（P<0.05）;培养1、4 d时，对照组与实验组的OD值比较，差异无统计学意义（P>0.05）;当细胞培养至7、10 d时，实验组的OD值均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;各实验组的OD值比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2、图4，封四）。

MC3T3细胞接种于含纯钛和纳米化钛板的一次性培养皿中培养6 h，激光共聚焦显微镜检测，在对照组中，可见肌动蛋白纤维多在细胞膜周围分布，呈车轮样排列，细胞多数成圆形、椭圆形，铺展面积小（图5A，封四）。在MAO不同电压处理表面，肌动蛋白纤维出现不规则伸展，部分细胞出现可以辨别的张力纤维肌丝，细胞伸展较为充分（图5B～D，封四）。

3讨论

刘继光等[11-14]研究表明，在钛金属表面通过等离子技术原位生成一层致密的具有较好生物相容性的陶瓷氧化膜。制作过程中钛金属试样浸在溶液里能观察到在其金属表面会有来回游动的火花微弧，击穿的过程总是发生在陶瓷氧化膜比较薄弱的部位衍生出均匀的生物膜，生物膜与金属体结合力比较强。本研究中通过在含有钙、硅离子的电解液中MAO工艺致使钛表面氧化膜在高电压下产生介电击穿作用，出现放电火花，是一种将钙、硅离子加入到钛金属生物膜表面的行之有效的方法。周睿等[15-17]报道了通过应用不同MAO工艺可以调整和控制纯钛表面氧化层的粗糙度、形态、孔径厚度、离子成分、生成物结构等参数。成骨细胞在种植体表面黏附，其附着对种植体成功获得初期稳定性有重要意义。本研究采用体外培养的成骨细胞，成骨细胞的成活率比较高，成骨细胞的生物学活性较明显。因此，成骨细胞是目前比较理想的细胞之一。本研究采用的是MC3T3细胞株，可以保证实验成果的可靠性。

田宏等[17-18]研究，在体外对成骨细胞进行培养，光滑钛金属表面成骨细胞的形态和黏附能力比较，差异有统计学意义（P<0.05）。在光滑钛金属表面成骨细胞梭形，与材料表面平行排列，电镜观察到在粗糙的钛片表面细胞矿化活动比较活跃。本研究结果显示，成骨细胞分别接种于不同电压下形成的钛金属氧化膜表面，观察实验组与对照组材料表面细胞的变化，不同电压处理后的实验组成骨细胞呈多边形，肌丝伸展良好，在材料表面有较好的黏附性，细胞伸展到材料表面的孔洞内，这可能是由于MAO处理使钛合金的表面粗糙度和表面能均显著增加，从而影响了其表面特性，所以促进了细胞在其表面生长，与对照组比较，其胞体较大，细胞突起更丰富。何梦乔等[18-19]研究显示，骨量不足时，表面粗糙的种植体比表面光滑的种植体成骨细胞有更高的黏附性，是影响骨结合强度的关键之一。本研究通过改变电压和改变电解液的配方，加入钙、硅离子，对微弧氧化工艺的进行了一定改进，在纯钛金属表面上成功制备出孔径均匀的多孔隙陶瓷薄层生物膜，通过一系列反应将直接钙、硅元素直接渗入到生物膜中，增加了材料表层的生物相容性。成骨细胞在制作出来的生物膜涂层表面可以黏附、增殖，具有良好的伸展性。

综上所述，在纯钛金属表面上通过改变电压和改变电解液的配方，制作出钛载钙硅MAO涂层，观察成骨细胞在不同处理的涂层表面附着、增殖，结果显示，采用MAO技术可以在纯钛表面形成含有钙硅复合氧化陶瓷涂层能有效促进成骨細胞的附着、增殖和伸展，其在活体组织中的研究有待进一步探讨。

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