超临界流体色谱技术在西酞普兰对映体拆分中的应用*

肖梦琦，聂小春

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.武汉药品医疗器械检验所，武汉 430075)

西酞普兰(citalopram)是治疗抑郁症的药物[1]，以消旋体形式给药，能选择性抑制5-羟色胺再摄取过程[2]。西酞普兰分子中有一个手性碳，存在R、S两种对映体，其中S-对映体药理活性远大于R-对映体[3]，已被拆分出来单独使用，即艾司西酞普兰(escitalopram)。现有西酞普兰对映体拆分方法以正相[4-6]或反相[7]高效液相色谱或与质谱联用[8]、毛细管电泳技术[9-11]较常见，而使用超临界流体色谱技术进行拆分[12-13]笔者较少见。超临界流体色谱技术的分离原理类似正相色谱，但使用超临界二氧化碳作为流动相，有机试剂的使用量大幅度减少，因此是一种更加环保的色谱方法。2012年，美国沃特世(Waters)公司基于超高效液相色谱技术平台，推出源于超临界流体色谱技术的超高效合相色谱(ultra performance convergence chromatography，UPC2)系统[14]，笔者在本实验使用该系统拆分西酞普兰对映体，以期为相关药品的质量控制提供新方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters ACQUITY UPC2超高效合相色谱仪(配有合相色谱管理器、样品管理器、二元溶剂管理器、PDA检测器、柱温箱管理器和Empower3工作站，美国Waters公司)；手性色谱柱：ACQUITY UPC2Trefoil CEL2，固定相为纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)；ACQUITY UPC2Trefoil CEL1，固定相为纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；ACQUITY UPC2Trefoil AMY1，固定相为直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，3种手性柱均由美国Waters公司生产，规格均为2.1 mm×50 mm，2.5 μm。

1.2试剂 二氧化碳(武汉钢铁集团氧气有限责任公司，批号：20180510，纯度：99.990%)；三乙胺(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170724，分析纯)；二乙胺(国药集团化学试剂有限公司，批号：20130326，分析纯)；甲醇(Fisher Chemical，LOT：178498，色谱纯)；乙腈(Fisher Chemical，LOT：175165，色谱纯)；异丙醇(Fisher Chemical，LOT：168323，色谱纯)；乙醇(Scharlau，BATCH：16719415，色谱纯)。

对照品：氢溴酸西酞普兰(含量：100.0%，批号：2001976，H.Lundbeck A/S，Copenhagen-DK，相对分子质量：405.3)；草酸艾司西酞普兰(即S-对映体，含量：99.0%，批号：V4013，H.Lundbeck A/S，Copenhagen-DK，相对分子质量：414.5)；样品：草酸艾司西酞普兰片(批号：P011401，P021401，P031401，韩国SK公司，规格：每片10 mg)。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的配制 对照品溶液A：精密称取氢溴酸西酞普兰对照品适量，甲醇溶解并定量稀释制成0.5 mg·mL-1溶液；对照品溶液B：精密称取草酸艾司西酞普兰对照品适量，甲醇溶解并定量稀释制成0.25 mg·mL-1溶液；对照品溶液C：精密量取对照品溶液A 1 mL，置于5 mL量瓶，用甲醇稀释制成0.1 mg·mL-1溶液；对照品溶液D：精密称取草酸艾司西酞普兰对照品适量，甲醇溶解并定量稀释制成5 mg·mL-1溶液；对照品溶液E：精密量取对照品溶液C和对照品溶液D各1 mL，置于试管中混匀；供试品溶液：取草酸艾司西酞普兰片样品1片，置10 mL量瓶，加适量甲醇浸泡至药片崩散，甲醇定容，摇匀，用孔径0.22 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2色谱条件的选择 在UPC2系统中设置样品温度20 ℃，进样量1 μL，强清洗体积200 μL(甲醇)，弱清洗体积600 μL(甲醇)，对手性柱的种类、改性剂与添加剂的种类和比例、柱温、背压、流速进行优化选择。西酞普兰S-对映体为有效成分，故各项考察指标(保留时间、分离度、对称因子和理论板数)按S-对映体计算。

2.2.1检测波长的选择 采用PDA检测器，在210～400 nm波长范围内扫描，西酞普兰在240 nm波长处有最大吸收，故选择检测波长为240 nm。

2.2.2手性柱的选择 笔者在实验中考察了ACQUITY UPC2Trefoil系列3种手性柱的分离效果。以超临界二氧化碳为流动相中主要组分，改性剂为甲醇-乙腈(9：1)，在流动相中占比9%；添加剂为三乙胺，在改性剂中占比为0.1%；柱温37 ℃；背压为11.72 MPa(1700 psi)；流速0.6 mL·min-1。使用对照品溶液A进样以观察分析效果，使用溶剂甲醇和对照品溶液B定位(图1)。在此条件下，分别使用3根手性柱进行实验。结果表明，CEL2柱可以实现西酞普兰R、S-对映体的拆分(图2)，而AMY1柱和CEL1柱不能拆分西酞普兰对映体，因此选用CEL2柱。

2.2.3改性剂种类的选择 采用CEL2柱，设置流动相中改性剂占比9%，柱温35 ℃，背压11.72 MPa(1700 psi)，流速0.7 mL·min-1，考察改性剂的种类对分离效果的影响，见表1。

由表1可知，当改性剂为甲醇-乙腈(9：1)时，对称因子最接近于1，理论板数最大，且分离度较大；当改性剂中没有加入三乙胺(添加剂)时，使用甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的任何一种都不能完全分离西酞普兰对映体。因此，应选择甲醇-乙腈(9：1)为改性剂，并加入适量的添加剂。

图1 西酞普兰S-对映体色谱图

Fig.1ChromatogramofcitalopramS-enantiomer

图2 西酞普兰在CEL2柱上分离的色谱图

Fig.2ChromatogramofcitalopramseparatedbyCEL2column

2.2.4添加剂的选择 采用CEL2柱，使用甲醇-乙腈(9：1)作为改性剂，设置流动相中改性剂占比9%，柱温35 ℃，背压11.72 MPa(1700 psi)，流速0.7 mL·min-1，考察添加剂的种类和比例对分离效果的影响。结果见表2，3。

由表2可见，使用三乙胺作为添加剂时分离效果更好。由表3可见，添加剂比例越大，流动相洗脱能力越强，但分离度就越小；当三乙胺在改性剂中的占比为0.1%时分离度最大，故选用0.1%三乙胺作为添加剂进行后续实验。

2.2.5改性剂比例的选择 采用CEL2柱，使用甲醇-乙腈(9：1)作为改性剂，0.1%三乙胺为添加剂，设置柱温35 ℃，背压11.72 MPa(1700 psi)，流速0.7 mL·min-1，考察改性剂在流动相中的占比对分离效果的影响，见表4。

由表4可见，改性剂比例越大，流动相洗脱能力越强，但分离度减小；改性剂比例为7%时虽然分离度最大，但分析时间较长；当改性剂比例为9%时，分离度和理论塔板数都较大，且节省了一定的分析时间；当改性剂比例为5%时，洗脱能力不足，主成分在色谱柱上保留，未能被洗脱。因此选用改性剂比例为9%进行后续实验。

2.2.6柱温的选择 采用CEL2柱，改性剂为甲醇-乙腈(9：1)，设置流动相中改性剂占比9%,添加剂为0.1%三乙胺，设置背压11.72 MPa(1700 psi)，流速0.7 mL·min-1，考察柱温对分离效果的影响，见表5。

由表5可见，在30～45 ℃，柱温越高，保留时间越短；当柱温为37 ℃时，分离度最大，对称因子最接近于1，理论塔板数较高。因此，柱温选择37 ℃。

2.2.7背压的选择 背压指的是色谱柱出口的压力，为保持流动相处于均一可控的状态，应控制柱后压力。采用CEL2柱，改性剂为甲醇-乙腈(9：1)，设置流动相中改性剂的占比为9%,添加剂为0.1%三乙胺，设置柱温37 ℃，流速0.7 mL·min-1，考察背压对分离效果的影响，见表6。

由表6可见，背压越大，保留时间越短；当背压为11.72 MPa(1700 psi)时，分离度最大，理论板数较高。因此，选择背压为11.72 MPa(1700 psi)。

2.2.8流速的选择 采用CEL2柱，改性剂为甲醇-乙腈(9：1)，设置流动相中改性剂的占比为9%,添加剂为0.1%三乙胺，设置柱温37 ℃，背压11.72 MPa(1700 psi)，考察流速对分离效果的影响，见表7。

表1 改性剂的种类对西酞普兰对映体分离的影响

Tab.1Effectofmodifiertypeontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

改性剂添加剂保留时间/min分离度对称因子理论塔板数甲醇-乙腈(55)0.5%三乙胺7.0061.7371.1222040甲醇-乙腈(64)0.5%三乙胺6.7661.8071.1272090甲醇-乙腈(73)0.5%三乙胺6.6491.6901.2091987甲醇-乙腈(82)0.5%三乙胺6.7041.7151.1092171甲醇-乙腈(91)0.5%三乙胺6.8961.7821.0972890甲醇0.5%三乙胺7.3791.7401.2582310乙醇0.5%三乙胺4.9761.4611.1962107

表2 添加剂的种类对西酞普兰对映体分离的影响

Tab.2Effectofadditivetypeontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

表3 添加剂在改性剂中的占比对西酞普兰对映体分离的影响

Tab.3Effectoftheproportionofadditiveinmodifierontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

比例/%保留时间/min分离度对称因子理论板数0.19.5752.0651.26424240.28.6881.9841.21424630.37.8671.8641.17822400.47.3671.8271.12923910.56.9381.7911.1432482

表4 改性剂在流动相中的占比对西酞普兰对映体分离的影响

Tab.4Effectoftheproportionofmodifierinmobilephaseontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

比例/%保留时间/min分离度对称因子理论板数5————715.9012.2121.230236699.4622.0421.2222417116.1371.8171.3202153134.3331.6431.2241999

表5 柱温对西酞普兰对映体分离的影响

Tab.5Effectofcolumntemperatureontheseparationofcitalopramenantiomers

n=5

由表7可见，当流速为0.6 mL·min-1时，分离度和理论塔板数的优势明显。因此选用0.6 mL·min-1的流速。

表6 背压对西酞普兰对映体分离的影响

Tab.6Effectofbackpressureontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

背压(psi)/MPa保留时间/min分离度对称因子理论板数10.34(1500)9.6162.0171.341271211.03(1600)9.1902.0401.184266711.72(1700)8.8892.0441.220270112.41(1800)8.6231.9951.286248513.10(1900)8.3792.0161.2112501

表7 流速对西酞普兰对映体分离的影响

Tab.7Effectofflowrateontheseparationofcitalopramenantiomersn=5

流速/(mL·min-1)保留时间/min分离度对称因子理论板数0.610.6582.3151.1983 1840.78.8892.0441.2202 7010.87.8772.0581.2842 4761.06.1981.8661.2142 0081.25.0911.7761.1851 886

2.2.9重复性实验 在优选的色谱条件下，使用对照品溶液A连续进样5次(该浓度下色谱峰的响应值适中)，计算得到R-对映体和S-对映体保留时间的平均值分别为9.047和10.658 min，RSD分别为0.30%和0.23%，2种对映体分离度的平均值为2.315，RSD为1.07%。结果表明该方法重复性良好。

2.3应用 在UPC2系统中设置优选的色谱条件[采用CEL2柱，以超临界CO2为流动相中主要组分，改性剂为甲醇-乙腈(9：1)，改性剂在流动相中的占比为9%，添加剂为0.1%三乙胺，柱温37 ℃，背压11.72 MPa(1700 psi)，流速0.6 mL·min-1，样品温度20 ℃，进样量为1 μL，检测波长240 nm]，使用对照品溶液E进样(图3)。对照品溶液E中R-对映体的浓度约为S-对映体浓度的1%，连续进样5次，R-对映体保留时间的平均值为9.122 min，RSD为0.42%，R-对映体峰面积的平均值为286 868，RSD为1.57%，重复性较好，表明该方法可以应用于艾司西酞普兰制剂的对映体杂质检查。

在优选条件下对3批样品(批号：P011401，P021401，P031401)进行测定，结果草酸艾司西酞普兰片中R-对映体的含量分别为0.38%，0.39%，0.36%。

图3 对照品溶液E色谱图

3 讨论

笔者在本实验中采用超临界流体色谱技术，以超高效合相色谱系统，考察了手性柱的种类、改性剂与添加剂的种类和比例、柱温、背压、流速对西酞普兰对映体分离的影响，最终确定优选的色谱条件为：采用ACQUITY UPC2Trefoil CEL2手性柱，以超临界CO2为流动相中主要组分，改性剂为甲醇-乙腈(9：1)在流动相中占比为9%，添加剂为0.1%三乙胺，柱温37 ℃，背压11.72 MPa(1700 psi)，流速0.6 mL·min-1，样品温度20 ℃，进样量为1 μL，检测波长240 nm。在此条件下，能够在13 min内使西酞普兰R、S-对映体完全分离，分离度为2.315，分离效率高，重复性良好，可以应用于艾司西酞普兰制剂的对映体杂质检查。

超临界流体色谱技术可以用于多种化合物的分离分析，由于流动相的主要组分为CO2，有机试剂的使用量非常少，因此产生的废液较常规HPLC减少很多，对环境的污染更小，并且节约成本，为药品质量控制提供了一种更为环保的新方法。