硫辛酰胺对高糖条件下肾小管上皮细胞氧化应激及转化生长因子β激活酶1和核转录共抑制因子蛋白表达的影响

毛彦稳 张小欢 刘慧铭 王圆圆 汤磊 郭兵

贵州医科大学1病理生理学教研室，2重大疾病发病机制及药物防治特色重点实验室，3医药卫生管理学院（贵阳550025）

研究表明，由持续高血糖状态和晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）的增加引起的氧化应激是糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）早期发病机制之一［1-5］。在DN 病理进程中，氧化应激的发生造成肾小球内皮细胞、基底膜细胞及系膜细胞发生氧化损伤，蛋白尿增多，最终使得肾功能受损［6-7］。硫辛酰胺（dl-alphalipoamide，ALM）对氧化损伤的保护作用更多的是作为一种间接抗氧化剂，同时刺激线粒体生物合成和诱导Ⅱ期抗氧化酶，且对糖尿病周围神经病变也有防治作用［8］。本课题组前期研究发现［9-11］，高糖（high glucose，HG）条件下，核转录共抑制因子SonN（ski-related novel protein N，SnoN）具有抑制细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）的沉积和肾小管上皮细胞向间质细胞转分化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）发生的作用［12-13］，表明SnoN 蛋白在延缓肾小管上皮纤维化进程中扮演重要角色。另有研究发现，活化的TAK1 可通过磷酸化SnoN 从而促进其泛素化并降解，降低SnoN 蛋白的稳定性［14］，转化生长因子β激活激酶TAK1［transforming growth factor-β（TGF-β）-activated protein kinase 1，TAK1］活化后还可调节ECM的发生［15］。因此，本研究旨在探究ALM 降低高糖时肾小管上皮细胞氧化应激损伤的作用是否通过介导TAK1 及SnoN 蛋白的表达而实现的，为临床延缓DN 的病程提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂硫辛酰胺（上海生工，中国），DMEM 细胞培养基（Hyclone 公司，美国），TAK1，p-TAK1（Thr184/187）（CST 公司，美国），SnoN（Santa Cruz 公司，美国），CollagenⅢ，Desmin（Sigma 公司，美国），β-actin 单克隆抗体（博士德公司，美国），胎牛血清（Gibco 公司，美国），一抗稀释液，TritonX-100，BCA（bicinchoninic acid）蛋白浓度测定试剂盒，ECL 显色剂（北京碧云天生物研究所），FITC-anti-α-SMA（abcam公司，美国），PE-anti-E-cadherin（BD 公司，美国），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、总超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）检测试剂盒（南京建成公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组细胞随机分为：（1）正常糖（NG）组：2% FBS+DMEM+5.5 mmol∕L Glucose；（2）高糖（HG）组：2%FBS+DMEM+25 mmol∕L Glucose；（3）高糖+硫辛酰胺组（HG+ALM）：2% FBS+DMEM+25 mmol∕L Glucose+ALM（200 μmol∕L），分别处理至6 孔板、培养皿及培养瓶中，48 h 后收取细胞蛋白，供各检测指标的进行（包括Western Blot 及氧化应激）。

1.2.2 细胞免疫荧光细胞接种至铺有盖玻片的6 孔板中，将生长状态良好，融合度达到70%的NRK-52E 细胞加入细胞静止液，置（37 ℃，5%CO2）培养箱16 h，使细胞同步化生长，PBS 37 ℃漂洗细胞3 次，5 min∕次，预冷细胞固定液固定20 min，PBS 37 ℃漂洗细胞3 次，5 min∕次，吸取多余封闭液，加入用细胞免疫荧光一抗稀释液分别配置的特异性一抗E-cadherin（1∶200），平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（1∶100），4 ℃慢摇孵育过夜。室温下复温10 min，细胞漂洗液37 ℃漂洗细胞3 次，5 min∕次。按免疫荧光试剂盒说明书操作，把荧光标记二抗按1∶1 000 比例用试剂盒提供二抗稀释液进行稀释E-cadherin 孵育抗兔FITC，α-SMA 孵育抗小鼠Cy3，37 ℃避光孵育1 h，细胞漂洗液37 ℃避光漂洗细胞3 次，5 min∕次。DAPI 按说明书稀释后室温避光孵育10 min，细胞漂洗液37 ℃避光漂洗细胞3 次，每次5 min。用试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液滴至载玻片上，盖上载玻片。OLYMPUS-DP72 倒置荧光显微镜观察并采集图像。

1.2.3 Western Blot 检测提取细胞蛋白，加入蛋白裂解液后离心、取上清用，BCA 试剂盒（碧云天）测定各组蛋白质浓度，按所测得浓度计算每泳道所需体积，加入加样缓冲液煮沸10 min。经10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离，再转移至PVDF 膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，加入SnoN 及TAK1、p-TAK1（Thr184/187）、E-cadherin、α-SMA、Desmin、β-actin一抗，工作浓度分别为1∶800、1：600、1∶800、1∶800、1∶800、1∶800、和1∶1 000，4 ℃孵育过夜。次日用TBST 洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的2 抗（浓度均为1∶6 000）室温孵育1 h，再加入ECL 化学发光试剂，曝光，Bio-Rad 凝胶成像系统扫描胶片，软件分析各条带的面积和灰度值，两者乘积为积分灰度值，每个样本重复操作3 次。一张胶上SnoN 及TAK1、p-TAK1（Thr184/187）、Ecadherin、α-SMA、Desmin 与相应的β-actin 条带所测积分灰度值的比值，即相应蛋白的相对表达量。

1.2.4 氧化应激氧化应激损伤指标丙二醛（malonaldehyde，MDA）及抗氧化应激指标总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）检测胰酶消化细胞，10% FBS 培养基终止消化，12 000 r∕min离心15 min，弃上清。按说明书加入相应试剂，并在酶标仪上测各管的吸光度值并计算浓度。

1.2.5 流式细胞技术检测培养细胞，待其密度在1×106∕mL，胰酶消化细胞至于离心管中，用预冷的PBS 洗3 次，并加入适量PBS 重悬细胞，置于EP管中，将重悬好的细胞随机分组：对照组、PE 单染组、FITC 单染组、实验组（双染），向相应组别中加入0.1 ～10 μg∕mL的PE或者PITC标记的抗体，轻轻混匀，室温或者4 ℃避光孵育30 min，用预冷的PBS清洗细胞，400×g离心5 min，重复3 次，弃上清，加入500 μL 预冷的PBS 重悬细胞，上机检测，按照顺序：对照组、PE单染组、FITC单染组、实验组（双染）依次设门，进行阳性细胞计数，结果以百分数表示。

1.3 统计学方法实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 19.0 软件，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾小管上皮细胞（NRK-52E 细胞株）表型鉴定细胞免疫荧光结果：NG 组NRK-52E 细胞胞浆中上皮细胞标志物E-cadherin 蛋白阳性染色较多，间充质细胞标志物α-SMA 蛋白的阳性染色较少；而HG 组E-cadherin 蛋白阳性染色减少，α-SMA 蛋白阳性染色增多，提示所培养的细胞为上皮来源细胞，其表型及生物学特性良好，高糖刺激之后细胞发生了EMT（图1）。

免疫印迹结果：培养NRK-52E 细胞发现，与NG 组比较，HG 组中上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达减少，而Desmin 蛋白（间充质细胞另一标志物）表达增高，差异具有统计学意义（P ＜0.05，图2），并与免疫荧光结果一致。

2.2 氧化应激水平的检测与NG 组相比，HG 组的氧化应激损伤指标MDA 的含量升高，抗氧化应激指标T-SOD 的含量降低；与HG 组相比，HG+ALM 组MDA 含量减少，T-SOD 含量增加，差异有统计学意义（P ＜0.05，表1）。

2.3 各组NRK-52E 细胞中p-TAK1（Thr184/187）、TAK1 和SnoN 蛋白的表达情况与NG 组相比，HG 组p-TAK1（Thr184/187）、TAK1 蛋白水平表达增加而SnoN 的表达降低；与HG 组相比，HG+ALM（200 μmol∕L）组p-TAK1（Thr184/187）、TAK1蛋白水平表达减少而SnoN 的表达增加，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图2 Western Blot 显示各组NRK52E 细胞中E-cadherin 及Desmin 蛋白的表达Fig.2 The expressions of protein E-cadherin and Desmin in NRK-52E cells showed by Western Blot

表1 氧化应激显示各组氧化应激水平的比较Tab.1 The comparison of oxidative stress levels in each group ±s

表1 氧化应激显示各组氧化应激水平的比较Tab.1 The comparison of oxidative stress levels in each group ±s

注：与NG 组比较，*P ＜0.05；与HG 组比较，#P ＜0.05

分组NG 组HG 组HG+ALM 组T-SOD（U∕mgprot）119.69±27.82 39.15±11.94*66.89±8.19#MDA（nmol∕mgprot）4.86±1.04 23.86±1.84*11.16±0.73#

2.4 各组NRK-52E 细胞中EMT 和ECM 蛋白指标的表达情况流式细胞术结果显示：采用FITC标记的α-SMA 抗体和PE 标记的E-cadherin 抗体，分别检测了NG 组、HG 组以及HG+ALM 组中荧光变化。与NG 组相比，HG 组中FITC 荧光值增加，PE 荧光值减少，即细胞中α-SMA 表达上调，E-cadherin 表达下调；而与HG 组相比，HG+ALM 组FITC荧光值减少，PE 荧光值增加，即α-SMA 表达下调，E-cadherin 表达上调，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4）。

图3 Western Blot 显示各组NRK52E 细胞中p-TAK1（Thr184/187）、TAK1、SnoN 蛋白的表达Fig.3 The expressions of protein p-TAK1（Thr184/187），TAK1，SnoN in NRK-52E cells of each groups showed by Western Blot

2.5 Western Blot 结果与NG 组相比，HG 组CollagenⅢ蛋白水平表达增加而E-cadherin 的蛋白水平表达降低；与HG 组相比，HG+ALM 组CollagenⅢ蛋白水平表达减少，而E-cadherin 的蛋白水平表达增加，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5）。

3 讨论

图5 Western Blot 显示各组NRK-52E 细胞中CollagenⅢ、E-cadherin 蛋白的表达Fig.5 The expressions of proteinCollagenШ，E-cadherin in NRK-52E cells of each groups

高血糖时，糖基化终末产物异常增多，抗氧化酶活性及清除自由基能力降低，抗氧化系统防御能力下降，最终导致氧化应激的发生，氧化应激反应过度是促进肾纤维化发生EMT 和诱导ECM 沉积的主要环节之一［16］。TGF-β1 是促进肾脏纤维化发生的主要因子之一［17］，TAK1 是TGF-β1 的下游因子，经TGF-β1 刺激后发生活化，进而调控下游靶基因的转录并发挥相应的生物学效应。研究发现［18］，TAK1 可促进ECM 沉积，表明其在器官纤维化的进程中亦扮演重要色。SnoN 通过负性调控TGF-β1∕Smads 信号通路，抑制TGF-β1 致肾脏纤维化生物学效应，延缓肾纤维化的发生发展，达到保护肾脏的作用［19］。在肿瘤细胞中有研究发现［15］，受TGF-β1 活化的TAK1 使得SnoN 发生多位点磷酸化，进而促进SnoN 发生泛素化水平修饰以降低SnoN 蛋白水平。ALM 具有抗氧化性能够清除氧自由基，研究发现［20］，ALM 能够抑制EMT 的发生，并呈剂量依赖性，本课题组前期研究表明［21］，对糖尿病肾病大鼠给予ALM 干预后，能够减轻肾脏组织的氧化应激损伤，改善肾脏病变。在肾纤维化的进程中，TAK1 对SnoN 蛋白的这种稳定性调节是否存在，及ALM 是否是通过影响TAK1∕SnoN 轴，抑制EMT 的发生，并减轻氧化应激损伤，不甚清楚。因此，本研究以体外高糖培养的NRK-52E 细胞为研究对象，检测ALM 对高糖时肾小管上皮细胞氧化应激及纤维化的效应。

本结果显示，高糖环境下，肾小管上皮细胞中的氧化应激指标水平增加，TAK1、p-TAK1（Thr184/187）及CollagenⅢ的表达增多，SnoN 与E-cadherin表达水平下降。给予ALM 干预后，氧化应激的水平降低，TAK1、p-TAK1（Thr184/187）及CollagenⅢ的表达下降，SnoN 蛋白表达增多。表明，高糖条件下，肾小管上皮细胞发生了氧化应激损伤，并伴有TAK1 的活化及高表达，SnoN 蛋白表达下降，胶原蛋白的沉积。ALM 干预后减轻了肾小管氧化应激损伤，下调了TAK1 的表达，上调了SnoN 蛋白的表达，并减少了胶原蛋白的表达。此结果与本课题组前期体内研究结果是一致的。如前所述，在肿瘤细胞研究中，TAK1 通过介导SnoN 的磷酸化进而促进SnoN 发生泛素化修饰，以调节SnoN 蛋白的稳定性。结合本研究及本课题组前期的发现，提示，高糖时，活化的TAK1 使SnoN 蛋白磷酸化，从而被泛素化降解，最终使SnoN 蛋白水平减少，促进肾纤维化病变。ALM 不仅减轻了高糖时细胞发生的氧化应激损伤，并通过影响TAK1∕SnoN 轴，恢复SnoN 蛋白水平，从而抑制EMT 的发生及ECM 的沉积，延缓了高糖诱导的肾纤维化进程。但是，TAK1 介导SnoN 发生磷酸化的具体位点及促进SnoN 发生泛素化水平修饰的机制，仍需进一步实验证明。

综上所述，抗氧化药物ALM 可能通过增加肾小管上皮细胞的抗氧化能力，减弱TAK1 对SnoN蛋白的负调节作用，上调SnoN 蛋白水平，从而抑制高糖环境下肾纤维化的发生发展，因此，深入探讨ALM 在DN 中的作用，这为临床防控及治疗DN提供了新的药物理论基础。