环状RNA circ0008016在胶质瘤患者组织中的表达及临床意义

白义凤 胡洪林 邓颖 刘宇

四川省医学科学院·四川省人民医院肿瘤中心（成都610071）

胶质瘤是最常见颅内原发性恶性肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的47.1%，也是神经系统最棘手的难治性肿瘤之一［1］。目前胶质瘤的治疗主要以手术切除结合术后放化疗为主，但由于胶质瘤呈弥漫性生长，做不到完全切除，且对放化疗敏感性差，因此患者的预后差，中位生存期不足2年，5年生存率仅9.8%，治疗后复发率几近100%，目前临床上缺乏有效的早期诊断及临床疗效及预后评估指标［2-3］，寻求调控胶质瘤进展的靶向分子、开发更为有效的治疗药物及早期诊断及临床预后生物标志物是目前胶质瘤临床治疗中亟待解决的难题。

环状RNA（circRNA）是一种新型的具有独特性质的非编码RNA，它不具有5′端帽子和3′端尾巴，是以共价键形成的闭合环状分子［4］。circRNA对RNA 外切酶的降解具有抗性，因此具有比线性RNA 更高的生物稳定性。研究［5］表明，circRNA 在多种疾病的发生、发展中发挥着重要的作用，参与细胞增殖、凋亡、炎症等病理生理过程。此外，众多研究证实，circRNA 在肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达量差异显著，且相关circRNA 表达量与肿瘤细胞的恶性程度及侵袭性具有相关性［6］。然而关于circ0008016 在胶质瘤中的作用及机制目前国内外尚未见相关报道，本研究拟进一步研究circ0008016 在胶质瘤组织及细胞中的表达，分析其表达与患者临床病理特征及预后的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2014年1月1日至2018年12月30日于我院确诊的胶质瘤患者组织标本92 例，同时收集33 例脑外伤患者的正常脑组织标本作为对照组。依据2007年WHO 分级对所有样本进行病理分级（其中Ⅰ级胶质瘤12 例；Ⅱ级29 例；Ⅲ级24 例；Ⅳ级27 例）。80 例患者接受了替莫唑胺（TMZ）化疗，其中32 例患者对化疗敏感［化疗后肿瘤部分或完全缓解（PR 或CR）］，48 例患者化疗耐药［化疗后出现进展或疾病稳定（PR 或SD）］。所有患者术前均未经放疗、化疗以及其他中药免疫治疗。所有组织标本在手术切除后立即保存于2 mL 无菌冻存管并立即投至液氮中速冻。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。所有患者术后均进行了随访。随访起点为手术或病理活检日，末次随访时间为2019年5月1日，随访时间5 ～49个月，中位随访时间36个月，至随访截止日，存活病例30例，死亡病例59例，3 例失访。

1.2 细胞培养人胶质瘤细胞株U251、U87 及正常人脑胶质细胞HEB 均来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.3 细胞转染细胞转至6 孔板中培养，待细胞生长到70%汇合时，按分组LipofectamineTM2000 和OPTI-MEM I（Invitrogen）将si-circ0008016 表达载体和si-NC 空载体转入细胞，每组均设阴性对照，转染后24 和48 h，提取细胞总RNA 备用，并用G418筛选单克隆建立稳定转染细胞株。

1.4 CCK8 法检测细胞增殖取对数生长期的各组细胞，接种于96 孔板，每孔细胞数2.0 ×103细胞∕孔，每孔体积200 μL，分别于0、12、24、36、48、72 h，每孔加入CCK8 溶液20 μL，37 ℃继续孵育0.5 ～4 h，用酶联免疫检测仪测定450 nm 的各孔吸光度（A），以时间为横轴，吸光度（A）为纵轴，绘制细胞生长曲线。每次设3 个平行孔，至少重复2 次。

1.5 Real-time PCR 检测circ0008016 在胶质瘤组织中的表达水平采用TRIzol 方法提取组织标本中总RNA。将提取的总RNA，逆转录反应参照AMV 逆转录试剂盒说明，在20 μL 体系中加2 μg总RNA 进行cDNA 的合成。Real-time PCR 采用2 × SYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA 作为摸板，引物浓度0.4 μmol∕L，15 μL 体系进行扩增，每个待测样本设置3 个平行样，根据目标基因设计合成相应上下游引物进行PCR 扩增。以GAPDH 作为内参照。PCR 反应在定量PCR 反应仪上进行。3 次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行定量分析。

1.6 流式细胞仪分析细胞凋亡变化Annexin V∕PI 染色法。对数生长期的细胞以4×105∕孔接种于6 孔板中；将si-circ0008016 和si-NC 转入细胞，37 ℃培养48 h；收集细胞，PBS 洗涤2 次；细胞重悬 于100 μL 含Annexin V-FITC 和0.5 μg PI 的结合缓冲液（10 mmol∕L HEPES pH 7.4，0.15 mol∕L NaCl，5 mmol∕L KCl，1 mmol∕L MgCl2，1.8 mmol∕L CaCl2）中；避光室温孵育15 min；加入400 μL 结合缓冲液；流式细胞仪分析，按下列公式计算细胞的凋亡指数：细胞凋亡指数=（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数）∕总细胞数×100%。

1.7 CCK8 法检测药物敏感性实验以每孔3×103个细胞接种于96 孔培养板中，每孔加入100 μL培养液。待细胞贴壁后，参照替莫唑胺化疗药物的临床血浆高峰浓度，在各组转染细胞中分别加入0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000 倍临床血浆高峰浓度的化疗药物，每种药物的每一浓度设5 个复孔；阴性对照组：仅加细胞不加药物，设5 个复孔；空白调零组：仅加细胞培养液，设5 个复孔。培养24 h 后，每孔加新鲜配制的CCK8 溶液10 μL，37 ℃、5%CO2下继续培养4 h，在酶标仪上选择450 nm 波长测定各孔吸光度，计算各组细胞在不同浓度下的3 种化疗药物的存活率：细胞存活率=（实验组吸光度均值-空白对照组吸光度均值）∕（阴性对照组吸光度均值-空白对照组吸光度均值）×100%。实验重复3 次求平均值，以细胞存活率为纵轴，药物浓度对数为横轴作半对数图，并按作图法计算出3 种药物的IC50值。

1.8 统计学方法采用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析，计量数据采用表示。circ0008016在组织及细胞中的差异表达采用t检验分析。circ0008016 与各临床病理参数之间的关系使用Chi-Square 检验；采用Kaplan-Meier 法分析circ0008016 的表达与生存时间及预后的关系，应用单因素及Cox 比例风险模型分析影响胶质瘤预后的因素，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Circ0008016 在胶质瘤细胞及组织标本中的表达采用QRT-PCR 检测circ0008016 在胶质瘤细胞及组织标本中的表达，结果发现，circ0008016在人胶质瘤细胞株U251、U87 中的表达明显高于正常人脑胶质细胞HEB，差异有统计学意义（P＜0.001，图1A）。circ0008016 在胶质瘤组织中的表达明显高于正常脑组织标本，差异有统计学意义（P＜0.01，图1B）；随着胶质瘤分级的增加，circ0008016 的表达增加，差异有统计学意义（P＜0.001，图1C）；此外，circ0008016 在替莫唑胺耐药患者中的表达较替莫唑胺敏感患者明显增高，差异有统计学意义（P＜0.001，图1D）。

图1 QRT-PCR 检测circ0008016 在胶质瘤细胞及组织标本中的表达Fig.1 QRT-PCR was used to detect the expression of circ0008016 in glioma cells and tissues

2.2 胶质瘤组织标本中circ0008016 的表达意义根据circ0008016 的平均表达水平，将胶质瘤患者分为circ0008016 高表达组（circ0008016≥9.530）52 例及低表达组（circ0008016＜9.530）40 例，分析circ0008016 的表达与患者临床预后的关系，结果发现circ0008016 的表达与肿瘤WHO 分级、化疗敏感性及生存状态明显相关，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.3 circ0008016 的表达对胶质瘤患者生存的影响采用Kaplan-Meier 法评估患者的生存时间，结果发现与低高表达circ0008016 的患者比较，高表达circ0008016 的患者的总生存时间及无复发生存时间明显缩短，差异具有统计学意义（P＜0.001），见图2A、2B。

表1 Circ0008016 的表达与胶质瘤患者中病理特征的关系Tab.1 The relationship of circ0008016 and the pathological features in glioma 例

2.4 circ0008016 对胶质瘤细胞增殖及化疗敏感性的影响进一步分析circ0008016 对胶质瘤细胞增殖及化疗敏感性的影响，结果发现与转染si-NC组比较，转染si-circ0008016 后能明显降低细胞中circ0008016 的表达，差异有统计学意义（P＜0.001，图3A），下调circ0008016的表达后能抑制细胞的增殖（图3B），促进细胞对化疗药物的敏感性（图3C）。

2.5 单因素及多因素分析影响胶质瘤患者预后的因素单因素分析发现circ0008016 的表达、WHO临床分级、对替莫唑胺的敏感性是影响胶质瘤预后的因素。多因素分析发现circ0008016 的表达、WHO 临床分级是影响胶质瘤患者预后的独立因素。见表2。

3 讨论

胶质瘤是中枢系统最常见的原发性肿瘤，国内报道约占颅内肿瘤的35% ～60%。其中，恶性胶质瘤的发病率为（5 ～8）∕100 万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第3 位［7-8］。脑胶质瘤可发生于任何年龄，成人患者平均发病年龄为40 岁，在10 岁左右儿童中亦有一个发病小高峰［9］。2008年世卫生组织数据显示，脑胶质瘤是34 岁以下肿瘤患者的第2 顺位死亡原因。由于脑胶质瘤侵袭性强、治疗棘手，其病因和发病机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗手段［10-11］。因此，阐明其发病机制以寻找有效的治疗手段一直是一个亟待解决的难题。

图2 circ0008016 的表达与胶质瘤患者无复发生存时间（A）及总生存时间（B）的关系Fig.2 The relationship between circ0008016 expression and the recurence free survival time（RFS）and overall survival time（OS）in glioma patients

图3 circ0008016 对胶质瘤细胞增殖及化疗敏感性的影响Fig.3 Effects of circ0008016 on proliferation and chemosensitivity of glioma cells

表2 影响胶质瘤患者预后的因素Tab.2 Prognostic factors of glioma patients

circRNA 是一类新的具有多种调控功能的非编码RNA，自1991年起，环状RNA 就开始有报道，但一直没有深入的研究［12］。2012年，SALZMANN等原先打算检测儿童急性淋巴细胞白血病细胞中的基因外显子错排，却意外发现了环状RNA（circular RNA，circRNA）在肿瘤和非肿瘤细胞中广泛存在。环状RNA 是在转录后，由前体mRNA 的反向剪接（backsplicing）形成，前体mRNA 的下游的剪接供体（downstream splice donor）的3′端与上游的剪接受体（upstream splice acceptor）的5′端共价结合形成的环状RNA 分子。由于是闭环状结构，缺乏RNA 酶的作用位点，环状RNA 结构稳定［13-14］。并且circRNA 含miRNA 结合位点，通过碱基互补配对原则海绵样吸附相关miRNA，从而调控下游基因的表达［15］，在调控肿瘤进展和转移中起着重要作用［16-17］。近年研究发现，环状RNA在肿瘤细胞与正常组织有不同的表达模式与表达水平，与肿瘤的发生、发展有密切的关系，环状RNA 有可能成为多种肿瘤的治疗靶点［18］。研究［19］发现circ_0001730 通过miR-326∕Wnt7B 环促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭。EIF4A3 诱导环状RNA MMP9（circ MMP9）作为海绵吸附mir-124，促进多形性胶质母细胞瘤的发生［20］。circPCMTD1 通过海绵吸附miR-224-5p 促进胶质瘤的进展［21］。课题组前期通过circRNA 芯片发现circ0008016 在胶质母细胞瘤（GBM）组织中高表达，circ0008016 转录自第8 号染色体上的FGFR1 基因（chr8：38287199-38287466，NM_001174064），生物信息结合信号通路串分析发现circ0008016 与EGF 之间存在潜在作用关系。进一步分析发现circ0008016在胶质瘤组织及细胞中的高表达；circ0008016 在高级别的胶质瘤患者明显高表达，与胶质瘤级别呈正相关；circ0008016 的表达与患者的肿瘤WHO分级、化疗敏感性及生存状态明显相关。YANG等［22］研究发现Circ-FBXW7 的表达与胶质瘤患者的总生存时间正相关。本研究发现高表达circ0008016 的患者的总生存时间及无复发生存时间较低表达者明显缩短。QIU 等［23］研究发现circ_0079593 通过海绵吸附miR-182 与miR-433 促进胶质瘤细胞的生长和侵袭，与患者的预后差相关。我们的研究发现下调circ0008016 的表达可抑制细胞的增殖，增加细胞对化疗药物的敏感性。单因素及COX 多因素回归模型分析提示，circ0008016的表达、WHO 分级是胶质瘤患者独立的预后因素。本研究首次发现circ0008016 在胶质瘤患者组织标本中高表达，与患者的预后相关，可作为潜在的胶质瘤早期诊断和预后评估的分子标志物。然而影响胶质瘤预后的因素复杂多样，其具体机制尚需进一步扩大样本量及分子生物学实验深入研究。