血管损伤后TGF-β1/Smad信号通路在诱导BMSCs分化参与血管再狭窄的相关性研究

郑仕杰 周敬群 杨维华 黄 迪 蔡金丹 戴秋婷 吕建峰

三峡大学附属仁和医院心血管内科，湖北宜昌 443000

冠心病发病的主要原因之一是血管内膜损伤后的血管再狭窄。近年来，随着血管介入治疗的广泛开展，血管损伤后再狭窄问题逐渐增多。有研究结果显示，在血管介入治疗的患者中，术后发生血管内再狭窄几率可达30%[1]。但目前有关血管损伤后再狭窄的具体病理机制暂不明确。既往研究认为，新生内膜的修复来源于血管损伤后的中膜平滑肌细胞和细胞外基质的参与，这是引起血管再狭窄的重要原因[2-3]。另有研究显示，血管损伤时其外膜的成纤维细胞可以分化为肌成纤维细胞，参与血管损伤后内膜的增生[4]。但也有文献报道，新生内膜的平滑肌细胞并非完全来自血管中膜和（或）外膜，BMSCs 可以通过分化参与损伤血管的新生内膜形成[5]。

同时研究发现，TGF-β1/Smad 信号通路与心血管疾病密切相关，在动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等疾病的发病中具有重要作用，但具体分子机制尚不明确。本实验旨在研究血管损伤后是否存在TGF-β1/Smad 信号通路的激活，以及BMSCs 参与血管损伤后重构的相关性研究。

1 材料与方法

1.1 材料与分组

选取健康雄性SD 大鼠48 只（350 ～450g，三峡大学动物实验中心提供），建立球囊导管损伤右侧颈总动脉损伤模型，按完全随机对照原则分6 组，每组8 只，即：对照组、实验0h、3d、7d、14d、21d 组。

1.2 主要试剂及仪器

DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物公司）、胎牛血清（Gibco 生物工程公司）、低糖DMEM（Gibco 生物工程公司）、兔抗人CD33（北京中衫公司）、兔抗人CD34（北京中衫公司）、兔抗人TGF-β1（浓度1 ∶200）（北京中衫公司）、兔抗人p-Smad2/3（浓度1 ∶50）（北京中衫公司）、兔抗人Smad2/3（浓度1 ∶50）（北京中衫公司）、兔抗人Nestin（浓度1 ∶600）Gibco 生物工程公司）、蛋白电泳条Marker、Western Blot 检测抗体（Gibco 生物工程公司）。PTCA 球囊导管、球囊导管压力泵、剪刀、镊子、手术缝合线、圆针、超净工作及操作台、低温高速离心机、奥林巴斯显微镜及图像采集系统、电泳仪、石蜡包埋机等。

1.3 右侧颈总动脉损伤模型的建立

SD 雄性大鼠常规备皮、消毒、覆盖洞巾及麻醉，暴露颈部组织，切开并逐级分离皮肤、肌肉至气管前，分离出右侧颈外动脉，于颈外动脉结扎处近心端用眼科剪剪成小切口，把球囊导管送至颈动脉内，往下送至主动脉弓处，以2 个大气压，缓慢拉出至切口处，反复此过程3 次后取出球囊，结扎颈外动脉，恢复血流，观察血流是否恢复。待血流恢复后，逐层缝合切口，放至饲养箱内。术后观察大鼠伤口有无红肿、渗血、死亡，苏醒后正常进食水。

1.4 取材

（1）分别于术后0h、3d、7d、14d、21d 时，手术取出损伤血管，长度约1cm，行石蜡包埋，切片及保存，以行组织形态学观察、免疫组化检测。（2）在术后0h、3d、7d、14d、21d 时，分离出损伤血管段，提取损伤血管组织蛋白，采用Western Blot 检测各个相关蛋白在损伤血管中的表达情况。

1.5 观察指标

1.5.1 组织形态学观察 通过HE 染色及在光镜下观察损伤血管新生内膜的增生情况。通过图像分析处理软件，以新生内膜区（I，intima）与中膜平滑肌区（M，media）比值（I/M 值）表示新生内膜增生程度。I/M 值越高，代表新生血管内膜增生程度越高，管腔面积越小，血管狭窄越重。

1.5.2 免疫组化检测 采用Envision 二步法，将切好的钠膜标本常规脱钠水，经过加入一抗、二抗、PBS 液浸洗等处理，DAB 显色后电镜下观察。

1.5.3 Western Blot 检 测 采 用SDS-PAGE 凝 胶不连续缓冲系统进行电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上，经过加入一抗、二抗、TBST 液浸洗等处理，待显色液中显色，出现条带时终止显色，记录各条带灰度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 两组在不同时间点损伤血管内膜的改变

对照组颈总动脉内膜由单层内皮细胞覆盖，中膜由平滑肌细胞构成，各时间点未见细胞异常增生及异常细胞形成。

实验组在术后0h 组、3d 组中，光镜下可见损伤血管的内皮细胞剥脱，无新生内膜形成；术后7d 组光镜下可见少许新生内膜形成；14d 组内膜厚度增生明显，21d 组增生最显著，见图1。通过HE 染色，观察新生血管内膜增生情况，结果显示，21d 组I/M值明显高于7d 组、14d 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1。

表1 实验组不同时间点I/M比值

2.2 实验组各时间点TFG-β1、p-Smad2/3、Smad2/3及Ki-67的关系

采用Wstern Blot 检测不同时间点TFGβ1、p-Smad2/3、Smad2/3 蛋白表达，结果显示，TFG-β1、p-Smad2/3、Smad2/3 的蛋白表达在术后7d 组开始升高，14d 组达到高峰，21d 组下降，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图2。比较实验组的p-Smad2/3、Smad2/3 灰度值，结果表明，14d 组比值均大于7d 组与21d 组（P ＜0.05），见图3。

同时，通过免疫组化Ki-67 染色，在不同实验组计数新生内膜的细胞数量，反应新生内膜细胞的增殖能力。结果显示，术后14d 组显著高于7d 组、21d 组，见表2。结果提示，TFG-β1、p-Smad2/3、Smad2/3 蛋白表达与细胞增殖同趋势化，猜测在损伤血管内TFG-β1/Smad 信号通路被激活，促进细胞增殖，参与了损伤内膜的增生过程。

2.3 实验组各时间点Nestin与TFG-β1的关系

通过Western Blot 法检测BMSCs 标记物Nestin蛋白，反映血管损伤后MSCs 聚集情况。结果显示，仅在7d 组及14d 组中有Nestin 蛋白的表达，其表达量结果显示14d 组高于7d 组（P ＜0.05），这与TGF-β1 的表达量同趋势化，见图4。实验结果提示，损伤血管新生内膜的形成过程，可能与TGF-β1 招募循环中的MSCs 聚集于血管损伤处有关。

3 讨论

图1 实验组不同时间点血管损伤后内膜形态（HE 染色，×100）

表2 实验组不同时间点新生内膜Ki-67染色细胞计数

图2 TGF-β1/Smad 信号通路的蛋白表达

图3 各实验组灰度值表达率

图4 Nestin 的蛋白表达及灰度值比较

近年来，随着血栓栓塞性疾病的发病率不断增加，临床上血管介入性治疗得以广泛开展，但介入性操作不可避免会造成不同程度的血管损伤，导致损伤后发生再狭窄问题也逐渐增多。有研究结果显示，在行冠脉支架植入的患者中，术后有30%的患者可发生冠脉血管内再狭窄[1]。大量研究认为，血管再狭窄与新生内膜增生有关[6-7]，但损伤后再狭窄的具体机制尚不明确。既往研究[3]认为，血管损伤后新生内膜来源于血管中膜平滑肌细胞积聚及合成细胞外基质沉积是导致血管再狭窄的主要原因。Pei 等[8]经球囊致小鼠颈动脉损伤，观察新生内膜形成，结果显示新生内膜中血管平滑肌的增殖和迁移，并增强了细胞外基质的沉积；另有研究[9]显示，血管外膜的成纤维细胞能够分化为肌成纤维细胞，参与内膜受损时新生内膜的增生过程。但随着干细胞的深入研究，人们发现来源于BMSCs 具有多分化潜能，在体外可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞及平滑肌细胞等，在生长因子及促迁移因子的调控下经过血液能够向损伤组织迁移并参与修复[10]。马发鑫等[11]研究炎症激活BMSCs 对辐射损伤大鼠小肠上皮干细胞的影响时，发现在小肠上皮细胞损伤处检测到BMSCs 的特异性标记，说明新生内膜的平滑肌细胞除了来源于血管中膜和（或）外膜，还可以通过BMSCs 分化参与损伤血管的新生内膜形成，但刺激或诱导BMSCs 迁移的主要细胞因子目前尚不明确。

TGF-β 生长因子具有多种生物学效应，可激活多个信号传导通路，而Smads 蛋白是一种信号转导通路，TGF-β1/Smad 信号转导通路与动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等疾病的发病密切相关[12]。Deepraj G 等[13]研究显示，在新生内膜增生过程中，TGF-β1 已被证明参与血管平滑肌的形成，且TGF-β1/Smad 信号与体外平滑肌细胞的增殖有关。因而有学者提出，在损伤血管修复过程中，文献中很少报道BMSCs 是否在生长因子或刺激物的作用下通过TGF-β1/Smad 信号转导途径参与新内膜形成和血管重塑。

本实验以大鼠颈部动脉内膜损伤为实验对象，在各个实验时间点选取损伤部位的颈动脉，观察血管内膜增生及狭窄程度。实验结果显示，在损伤后的不同时间点检测到新生内膜增生的程度不同，以损伤7、14、21d 组新生内膜增生明显，三组间的差异有统计学意义（P ＜0.05），且21d 组增生程度及I/M 值明显高于其他组（P ＜0.05）。为进一步检测TGF-β1/Smad 信号转导蛋白（TGF-β1、p-Smad2/3，Smad2/3）是否在损伤血管中表达及与细胞增殖关系。实验结果显示，TFG-β1、p-Smad2/3及Smad2/3 蛋白表达量在术后7d 组开始升高，14d 组达到高峰，21d 组下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。这与通过免疫组化Ki-67 染色，计数新生内膜的细胞数量的结果趋势相同，表现为术后14d 组显著高于7d 组、21d 组。实验说明，在损伤血管内TFG-β1/Smad 信号转导通路被激活，促进细胞增殖，参与了损伤内膜的增生过程。

在骨缺损修复的研究中，大量文献结果显示BMSCs 可分化为成骨细胞、软骨细胞，参与新骨的形成。研究还发现，TGF-β 可以诱导骨髓腔中BMSC 定向迁移，参与骨缺损修复，且在缺损处高表达自身标记物[14]。也有研究[15]发现，血管损伤后释放一些生物活性物质，可以动员BMSCs 进入血液循环，黏附于血管损伤部位，最终分化为血管平滑肌细胞，参与损伤的修复。李罗成等[16]证明BMSCs 参与血管损伤后新内膜的形成，且这些细胞表达平滑肌细胞标志。BMSCs 表达特定的免疫表型，通常强表达CD29、CD44、CD45、CD105、Nestin等。目前通常选用CD29 和Nestin 作为BMSCs 的表面标记。本实验通过Western blot 法检测BMSCs标记物Nestin 蛋白在血管新生内膜的表达，发现Nestin 蛋白仅在7d、14d 组及21d 组中表达，这与TGF-β1/Smads 信号转导通路开始激活时间点相同，进一步说明了，在损伤血管内TFG-β1/Smad 信号转导通路被激活，诱导了BMSCs 向损伤处聚集、分化及参与内膜增生，但BMSCs 在血管损伤后内膜增生过程中发挥的具体作用机制，尚需进一步研究。