相对湿度和培养时间对食线虫真菌Duddingtonia flagrans产孢量的影响

罗斌汉，潘 红，岑曼益，赵睿明，孙雨琪，罗千慧，侯俊达，王波波，蔺国珍*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130000）

动物寄生虫病是仅次于传染病的一大类疫病，由于存在土源性感染，因此在自然放牧的过程中，大部分动物均呈不同程度的感染。然而，目前主要依赖于化学驱虫药的使用，来控制动物寄生虫病的发展。但是，随着长期大量的使用化学驱虫药物，造成了一系列的问题，如化药残留、环境污染、耐药虫种的出现等[1,2]。因此，人们就去寻找一种能够补充或替代传统药学驱虫药，来进一步更好地防治动物寄生虫。因此，利用食线虫真菌与寄生线虫存在的生物拮抗作用，来进一步防控家养动物寄生线虫病的发展。其中，Duddingtonia flagrans是一种能够形成捕食器官的食线虫性真菌，该菌本身在自然界中就作为线虫的天敌而存在。该菌在生长发育的后期，能够产生大量的具有双层厚壁的孢子（厚垣孢子），该孢子不同于其它食线虫真菌所产生的分生孢子，它们抗逆性极强，能够通过动物消化道后仍然能保持活性[3-7]。目前D. flagrans作为胃肠道线虫生物防制的菌种，已在实验室阶段和田间条件下对绵羊、山羊、牛、马等动物进行了体内通过消化道试验已经证明对减少粪便中L3的数量是有效的[8,9]。然而，该菌在生长发育的过程中，环境中相对湿度和培养时间对其产孢量的影响至今仍不可知。

本研究的目的是探索该菌株在生长发育的过程中，随着培养时间的延长及环境中相对湿度对该菌的产孢量的影响，旨在获得该分离株最大产孢量的条件，为将来该菌株应用于家养动物寄生线虫生物防治制剂的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌种

食线虫真菌D. flagrans分离株（SDH035），由西北民族大学蔡葵蒸教授课题组提供，菌株在4 ℃下2%玉米粉琼脂斜面培养基保存。

1.2 培养基及其制备

水琼脂培养基（WA）：按照1.5 %～2 %浓度称取琼脂粉于三角烧瓶中，加入蒸馏水，121 ℃高压灭菌20 min，在超净工作台内完成倒制平板培养基，置于4 ℃保存备用。

麸皮琼脂培养基（WBA）：8%麸皮原液的制备：称量80 g麸皮，量取1 000 ml蒸馏水，加热保持微沸状态 1 h，经6层纱布过滤后，置于2 000 ml量筒内，并补足至1 000 ml，采用保鲜膜封口置于4℃冰箱静置过夜，吸取上清液，稀释至所需浓度，再加入1.5%～2 %的琼脂粉，121 ℃高压灭菌20 min，在超净工作台内完成倒制平板培养基，置于4 ℃保存备用。

麸皮培养液：按照上述方法制备浓度为8%的麸皮原液，稀释至2%浓度，121 ℃高压灭菌20 min，置于4 ℃保存备用。

产孢培养基：粮食培养基的总重量为120 g，主要成分是玉米和小麦，其比例是2：1，按照比例称取小麦和玉米放入500 ml锥形瓶加入1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4以及适量的蒸馏水，粮食与蒸馏水的比例是1.5：1，用硅胶塞盖住并用牛皮纸将其瓶口包好，121 ℃高压灭菌30 min，置于4 ℃保存备用。

1.3 仪器设备

超净工作台；恒温培养箱；恒温振荡培养箱（HZP—250 型）；光学显微镜（Leica DME 型）；倒置显微镜（Leica）；解剖针；锥形瓶；烧杯；研钵；漩涡振荡仪；高速离心机等。

1.4 厚垣孢子的生产

在超净工作台内，用2%玉米粉琼脂斜面培养基保存的菌株，在无菌环境下挑取少量菌丝，接种于WA平板中，置于28 ℃培养箱中培养6 d结束培养。用灭菌过的打孔器切取4 mm×4 mm大小含有菌丝的琼脂块，置于2%液体培养基中，每瓶8块，置于振荡培养箱中，180 r/ min，相对湿度分别设为35%和85%，28 ℃培养7 d后终止培养。上述培养物置于旋涡震荡仪中反复振荡10 min，按5%接种量将菌液接种至产孢培养基内，置于恒温培养箱中，28 ℃培养分别培养7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d。培养结束后，随机抽取5 g不同培养时间段的谷粒培养物，然后用0.05%（w）的灭菌Twain-80水将生长在谷粒表面的菌物洗脱下来，用双层纱布过滤，获得含有厚垣孢子的菌悬液，用血细胞计数版对其孢子进行计数，最后推算出每克谷粒产生的厚垣孢子数量。

2 结果

表1表明D. flagrans分离株在两种相对湿度、不同培养时间段的产孢量。从表1可知，在相同的培养时间下，85%的相对湿度所获得的产孢量显著高于35%的相对湿度。

图1显示了食线虫真菌D. flagrans分离株分别在35%的相对湿度下，在恒温培养箱中培养7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所获得的产孢量。结果显示，随着培养时间的延长，该菌株的产孢量逐渐升高，当培养时间为7～14 d时，产孢量缓慢上升，此后产孢量急速增加，在培养28 d后该菌株的产孢量趋于平缓，培养至49 d时其产孢量达到高峰。

图2显示了食线虫真菌D. flagrans分离株分别在85%的相对湿度下，在恒温培养箱中培养7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所获得的产孢量变化趋势。

表1 Duddingtonia flagrans分离株在两种相对湿度、不同培养时间段的产孢量

图1 食线虫真菌Duddingtonia flagrans分离株在不同培养时间段（相对湿度为35%）的产孢量

3 讨论

图2 食线虫真菌Duddingtonia flagrans分离株在不同培养时间段（相对湿度为85%）的产孢量

本研究通过对食线虫真菌D. flagrans分离株分别在35%和85%的相对湿度下，在恒温培养箱中培养7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后获取其厚垣孢子，并对其产孢量进行计数。研究结果表明，随着培养时间的延长，该菌株的产孢量逐渐升高，当培养时间为7～14 d时，产孢量缓慢上升，此后产孢量急速增加，在培养28 d后该菌株的产孢量趋于平缓，培养至49 d时其产孢量达到高峰。此外，该分离株分离株分别在35%的相对湿度下，在恒温培养箱中培养7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d后所获得的产孢量均显著低于85%的相对湿度所获得的产孢量。说明，该分离株在相对湿度较高的条件下更易于产生厚垣孢子。若在培养的过程中，环境中的相对湿度较低，将会直接影响该菌产生厚垣孢子的产量。