真空冷冻干燥对食线虫真菌谷粒培养物含水量的影响

孙雨琪，罗千慧，侯俊达，岑曼益，赵睿明，霍生东

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

消化道蠕虫感染已经对不同的药物产生了广泛的抗药性，这导致了迫切需要新的技术用于预防和控制家畜的寄生虫病。在新的抗蠕虫药的研发上必须要满足以下要求：使用这些药物要对人类和野生动物不产生毒性或毒性较低，对环境产生的影响要小，在畜产品中残留物少。在应用这些药物时为了达到预期的效果，用于控制反刍动物消化道蠕虫感染的新方法已经在进行中，即将重点放在利用食线虫真菌控制线虫的替代策略上[1-4]。通过利用食线虫真菌对线虫的生物拮抗来防治动物寄生线虫倍受关注，食线虫真菌它成为一类首要的控制有害动物线虫的生物因子,在整个动物控制线虫的一个非常重要的位置，是一种宝贵的资源，还没有被充分认识和利用。国内对这方面的研究还比较少[5,6],国外利用食线虫真菌防治动物线虫病已取得了一些进展[7-10]。

本研究的目的是探索食线虫真菌Duddingtonia flagrans当地分离株在谷粒培养基中培养后，在真空冷冻干燥箱中冷冻干燥不同时间对含有D. flagrans分离株（SDH035）的培养物中水分含量的影响，为将来该菌株应用于家养动物寄生线虫生物防治制剂的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌种

食线虫真菌D. flagrans分离株（SDH035），由西北民族大学蔡葵蒸教授课题组提供，菌株在4 ℃下2%玉米粉琼脂斜面培养基保存。

1.2 培养基及其制备

水琼脂培养基（WA）：按照1.5%～2%浓度称取琼脂粉于三角烧瓶中，加入蒸馏水，121 ℃高压灭菌20 min，在超净工作台内完成倒制平板培养基，置于4 ℃保存备用。

2%麸皮浸出液：称量20 g麸皮，量取1000 ml蒸馏水，加热保持微沸状态1 h，经6层纱布过滤后，置于2 000 mL量筒内，并补足至1 000 ml，采用保鲜膜封口置于4 ℃冰箱静置过夜，吸取上清液，置于4 ℃保存备用。

2%麸皮琼脂培养基（WBA）：在浸出液的基础上再加入1.5 %～2 %的琼脂粉，121 ℃高压灭菌20 min，在超净工作台内完成倒制平板培养基。

谷粒联合培养基：粮食培养基的总重量为120 g，主要成分是玉米和小麦，其比例是2：1，按照比例称取小麦和玉米放入500 ml锥形瓶中，再加入0.1%的 KH2PO4、0.05%的 MgSO4以及适量的蒸馏水使得粮食与蒸馏水的比例是1.5：1，用硅胶塞盖住并用牛皮纸将其瓶口包好，121 ℃高压灭菌30 min，置于4 ℃保存备用。

1.3 仪器设备

超净工作台；恒温培养箱；恒温振荡培养箱（HZP—250 型）；光学显微镜（Leica DME 型）；倒置显微镜（Leica）；解剖针；锥形瓶；烧杯；研钵；漩涡振荡仪；高速离心机；真空冷冻干燥箱等。

1.4 厚垣孢子的生产

在超净工作台内，用2%玉米粉琼脂斜面培养基保存的菌株，在无菌环境下挑取少量菌丝，接种于WA平板中，置于28 ℃培养箱中培养6 d结束培养。用灭菌过的打孔器切取4 mm×4 mm大小含有菌丝的琼脂块，置于2% 液体培养基中，每瓶8块，置于振荡培养箱中，180 r/ min，相对湿度设为85%，28 ℃培养7 d后终止培养。上述培养物置于旋涡震荡仪中反复振荡10 min，按5%接种量将菌液接种至产孢培养基内，置于恒温培养箱中，28 ℃培养25 d。终止培养。

1.5 谷粒培养物水分含量的测定

称取1.4中获得的含有真菌的谷粒培养物，记录其质量，根据公式计算出不同冷冻干燥时间点平皿的质量，其谷粒培养物中水分含量计算公式如下：

2 结果

图1显示了食线虫真菌D. flagrans分离株在真空冷冻干燥箱中分别冷冻干燥3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h后，含有厚垣孢子的谷粒培养物中的水分含量。结果显示，随着冷冻干燥时间的延长，谷粒联合培养物中的水分含量逐渐降低，分别为8.26%、41.26%、38.16%、35.18%、30.49%、25.49%、21.06%和18.26%。

图2显示了上述含有食线虫真菌厚垣孢子的谷粒联合培养物在真空冷冻干燥箱中经过不同时间点的冷冻干燥后，冷冻干燥时间与谷物水分含量之间的关系。由图2可知，真空冷冻干燥时间与谷粒含水量之间呈线性相关，随着真空冷冻干燥时间的延长，谷粒中的水分含量逐渐降低，其R2为0.992，其线性回归方程为：y=-4.2143x+59.675。

图1 真空冷冻干燥后谷粒培养物中水分含量测定

3 讨论

图2 真空冷冻干燥时间与谷粒含水量之间的线性回归分析

本研究通过对食线虫真菌D. flagrans分离株在真空冷冻干燥箱中分别冷冻干燥3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h后，含有厚垣孢子的谷粒培养物中的水分含量。结果证明随着冷冻干燥时间的延长，谷粒联合培养物中的水分含量逐渐降低，分别为8.26%、41.26%、38.16%、35.18%、30.49%、25.49%、21.06%和18.26%，且真空冷冻干燥时间与谷粒含水量之间呈线性相关，随着真空冷冻干燥时间的延长，谷粒中的水分含量逐渐降低，其R2为0.992，其线性回归方程为：y=-4.2143x+59.675。说明该含有食线虫真菌D. flagrans分离株的谷粒培养物在真空冷冻干燥的过程中，谷粒含水量受冷冻干燥的时间所影响，其中干燥时间越长，谷粒含水量就越低。因此，本研究提示在培养食线虫真菌D. flagrans的过程中，环境中的湿度将会直接影响培养物中的含水量，这一结果将可能导致培养后期产孢量的变化。