尖顶羊肚菌原基形成过程显微观察与分析

石建森，郭明慧，郭 尚，周 伟，王志伟，武 旭，李云霞

（1.山西省农业科学院食用菌研究所，山西太原030031；2.山西省农业科学院试验研究中心，山西太原030031）

羊肚菌（Morchella spp.）是一种非常珍贵的食用菌，隶属于子囊菌亚门（Ascomycota）盘菌纲（Discomycetes）盘菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）[1]。很久以来，人们一直致力于羊肚菌人工栽培的研究，并且不断地取得一些技术上的进步，使羊肚菌的大田栽培得以实现。2015 年以来，我国的羊肚菌栽培规模迅速扩张，目前已达0.67 万hm2左右。但遗憾的是，由于羊肚菌理论研究方面的欠缺，造成无法制定出精准的栽培工艺流程，产量一直徘徊在750～2 250 kg/hm2的水平，80%～90%的种植户处于亏本状态。

在羊肚菌的理论方面，原基的形成过程是一个有争议的关键问题。大部分人认为，羊肚菌原基形成与平菇、香菇等担子菌的原基形成大体类似，是由菌丝扭结形成原基的。这个理论的代表人物有OWER 等[2-6]，他们提出了以菌核为中心的羊肚菌生活史，即由菌丝形成菌核，适宜条件下菌核又萌发形成菌丝，再由菌丝扭结成原基。但是有许多试验证明，菌核的有无与出菇与否以及产量高低之间没有必然的联系，有菌核产生的菌株不一定出菇，很少形成菌核的菌株同样也可以出菇[7-9]。到目前为止，尚无菌核萌发成原基的直接证据。在后来的科学研究中，赵永昌等[9]研究发现，原基的形成数量与分生孢子形成相关，没有分生孢子的都未形成原基。石建森等[10]的研究结果支持以上观点，他们指出分生孢子与原基形成存在着正相关的关系，即分生孢子多的地方原基发生就多，分生孢子少的地方原基就少。

关于分生孢子在羊肚菌发育过程中的作用，国外研究者OWER 等[2，5，11]做了大量的工作，结果表明，羊肚菌的分生孢子单独培养不能萌发[2-9]。JACOBS 等[12]及我国学者刘伟等[13]研究指出，羊肚菌的无性孢子像多数真菌的小分生孢子均难以萌发，功能上可充当有性繁殖中的不动精子的作用，而非传统意义上的无性孢子繁殖体作用。这就暗示了分生孢子在羊肚菌的发育过程中可能要参与一个有性繁殖的过程。2017 年谭昊等[14]研究认为，羊肚菌分生孢子类似于花粉的作用，对出菇有重要意义。2019 年山西省农科院食用菌研究所石建森等[10]在大量试验观察的基础上提出了一个新的理论，这个理论的主要观点是羊肚菌原基是由分生孢子与活跃菌丝交配形成的。这个理论比较圆满地解释了分生孢子单独不能萌发及分生孢子与原基形成的正相关关系。重要的是，这个理论把原基形成过程描述为分生孢子与活跃菌丝的有性交配过程，而非原来的无性菌丝扭结过程。

本研究对尖顶羊肚菌（Morchella conica）的原基形成过程进行了详细的显微观察，进一步探讨分析了分生孢子、活跃菌丝与原基形成的关系，是笔者所提出的羊肚菌生活史新模型的补充研究[10]，其目的是使人们从另一个角度来观察羊肚菌原基的形成过程，从而得出更加科学的结论。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试栽培菌株为尖顶羊肚菌8 号，来自山西省农业科学院食用菌研究所菌种保藏室。

1.2 试验方法

羊肚菌栽培试验在山西省农业科学院东阳试验示范基地12 号、16 号大棚进行。2018 年11 月19—20 日播种，播种后浇大水，3 d 后菌丝萌发。12 月1 日畦面上有大量气生菌丝产生，12 月7 日棚内有结冰，畦上形成大量菌霜。2019 年2 月25 日浇出菇水，3 月21 日开始大批量出菇，发现有小菇已达1 cm。

1.3 显微观察

从3 月21 日起，每隔3 d 取样一次进行显微观察，于山西省农业科学院食用菌研究所实验室进行光学显微镜观察与拍照。

2 结果与分析

2.1 活跃菌丝上芽基形成显微观察

试验结果表明，羊肚菌播种后在土壤中分化成2 种菌丝，菌丝大体上分化成2 种形态，一是土壤表面的气生菌丝，这种菌丝在土壤表面迅速生成分生孢子，俗称菌霜，然后气生菌丝快速衰退；二是土壤中形成活跃菌丝，这种菌丝常呈网络状、颜色深、韧性强，生命周期比气生菌丝长。活跃菌丝在前期外表光滑、透亮（图1-A、B），后期在浇出菇水后，土壤表面潮湿，活跃菌丝上形成许多凸起，这些凸起有的不规则，有的呈球状（图1-C、D、E、F）。推测这些凸起物是分生孢子与活跃菌丝接触相互作用后有丝分裂形成的，是原基形成的最初期，暂命名为芽基。

2.2 菊花期显微观察

从芽基四周辐射长出新的菌丝，与活跃菌丝比较，这些菌丝呈现出颜色浅、较细、有相当的一致性，可以看出，是从芽基上延伸出来的。这些新生的菌丝宛如花瓣一样，从侧面观察就像一朵菊花，常常连成一片，将其命名为菊花期（图2），这是原基形成的第2 个时期。还可以观察到在一根活跃菌丝上可以串联形成多个原基（图2），在某一点上也可形成2 个或2 个以上的原基。

2.3 原基分化显微观察

在菊花期后，紧挨土壤的新菌丝逐渐向下长入土壤中，从土壤中吸取营养，以后形成羊肚菌的假根。相对向上的一面颜色逐渐变深，由淡墨色变成深黑色，伸长形成羊肚菌的子囊果部分（图3）。

还可以观察到，羊肚菌原基起初在活跃菌丝的表面某一点或多点生成，随着原基长大，活跃菌丝被原基包裹于根部，后来形成由一根菌丝串连多个原基的状况（图3），说明这些活跃菌丝不仅在原基形成时起着重要的作用，而且可能在假根形成前担负着给原基输送营养、水分的任务。

3 结论与讨论

关于羊肚菌子实体的形成机制与过程是羊肚菌理论方面的一个重大问题，OWER 等[2，5]首先提出羊肚菌的子实体是由菌核长出来的，VOLK 等[3]在OWER 理论的基础上提出一个完整的生活史模型，至今这个理论被人们广为接受。但是在这个理论中把分生孢子完全排除在外，被后来学者的研究认为是不妥当的。赵永昌等[9-10]都观察到羊肚菌原基的数量与分生孢子存在着正相关的关系。在生产实践中人们常常见到的“边缘效应”更直观的看到了分生孢子的聚集区域会有大量原基产生。这一点可以作为分生孢子参与原基形成的直接证据。石建森等[10]提出了一个新的羊肚菌生活史模型，在这个模型中羊肚菌分生孢子与活跃菌丝相互作用才能产生原基的理论也许可以让人们对羊肚菌原基形成机制有一个更加科学的认识。

本研究通过对羊肚菌活跃菌丝及原基形成过程的详细观察分析，更为明确的阐述了羊肚菌原基形成是一个分生孢子与活跃菌丝相互作用后的有丝分裂过程，而非无性的单一菌丝扭结过程。这个结论与CARRIS 等[11-13]关于羊肚菌的分生孢子在形态特征上类似于其他真菌的小分生孢子，多数真菌的小分生孢子均难以萌发，功能上可能充当有性繁殖中不动精子的作用，而非传统意义上的无性孢子的繁殖作用的推论相吻合。MOLLIARD 等[5，2，11]的试验均证实，羊肚菌的分生孢子均不能单独萌发，也从另一个侧面支持了本研究结果。

尽管在羊肚菌原基形成方面进行了大量的研究工作，但是还需要在细胞学水平对分生孢子、活跃菌丝、芽基、菊花期等阶段的核型进行分析与研究，以进一步完善所提出的新理论。