导入野生罗勒基因的烟草对镉胁迫的耐性与生理响应

魏克强，郭婷婷，宋 欣，庞胜喜

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.保定幼儿师范高等专科学校，河北涿州072750；3.山西大地环境投资控股有限公司，山西太原030032）

近年来，我国土壤重金属镉的污染状况日趋严峻，对生态环境、农业生产和食品安全造成了严重威胁。镉是植物生长的非必需元素，其移动性大、生物毒性强，且易被吸收、富集。利用某些植物能够耐受镉毒害和超量积累的特性清除环境镉污染的技术即植物修复，是实现土壤污染治理与生态修复的有效策略。但目前可利用的野生物种极其有限，人工培育出的优良品种更是屈指可数[1-2]。植物提取是目前研究最多的一种植物修复技术，而筛选、培育超积累植物已成为当务之急[3]。

唇形科罗勒属（Ocimum）草本植物的分布广泛、遗传多样性丰富，常作为观赏、医药、工业等多种用途的芳香植物而栽培[4]。近年来发现，其某些野生种对重金属的耐受和富集能力较强，是一种潜在的镉超积累植物[5-7]。但在严重污染的土壤，罗勒生长缓慢、植株矮小、生物量低，实际应用存在较大的局限性。相对于超积累植物，一些具有适应性广、生长周期短、生物量高、富集能力强、抗逆性好等优点的作物表现出了较高的修复潜力，其中，烟草是比较理想的物种之一[8-9]。

栽培烟草（Nicotiana tabacum L.）极易将吸收的镉富集在叶片（富集系数可达5～10），但它还不是超积累植物[10-11]。国内外利用转基因技术改良烟草植株摄取、转运、耐受和积累重金属的特性已有大量的研究[12]。远缘杂交可以促进远缘物种间的基因渐渗、交流和重组，是将不同生物类型的优良性状结合起来创造变异、形成新物种和新类型的重要手段，这为利用野生超积累植物的基因资源创制修复污染土壤的烟草新种质提供了可能[13-14]。

本研究以亲本普通烟草78-04、罗勒（Ocimum basilicum L.）及其F2为材料，采用水培法初步分析了导入野生罗勒基因的烟草植株对镉胁迫的耐受性与生理响应，旨在为进一步挖掘和利用基因资源开展植物修复的研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

野生罗勒（Ocimum basilicum L.），种子采自山西省晋中市某钢铁冶炼厂附近，自然晾干后保存；普通烟草（Nicotiana tabacum）栽培品种78-04，由山西农业大学烟草育种研究室提供；参考WEI 等[13-14]的方法，获得（（Nicotiana sylvestris＋78-04）×Ocimum basilicum）杂交组合的F2材料。

1.2 试验方法

选取籽粒饱满的各试验种子，以3%NaClO 浸泡消毒10 min，再以蒸馏水反复冲洗3～5 次后，分别播种于装满珍珠岩的发芽皿中出苗。待长至4 叶期，移入水培箱进行Hoagland 营养液（购自海博生物公司，青岛）培养。每个水培箱在铺设的泡沫板上打6 个孔，每个孔移栽1 棵幼苗，室温（26±2）℃，光照16 h/d，缓苗7 d 后进行镉胁迫试验。

参考文献[14-15]的方法，在预试验中先设置5 个浓度的镉（0，50，100，200，300 μmol/L CdCl2）持续处理10 d，以对照组（0 μmol/L）为参照，2 个亲本材料间做对比，选出毒性症状差异明显的1 个最大浓度（300 μmol/L）作为本试验的染毒浓度。然后选择生长健壮、长势一致的亲本幼苗，分别移栽到含300 μmol/LCdCl2的Hoagland 营养液中继续培养，同时设不添加镉的对照组，每个处理重复3 次。镉以CdCl2·2.5H2O（分析纯）加入营养液中，每2 d 更换一次新鲜培养液，以HCl 或NaOH 调pH 值，使pH值在6.0 左右。F2种子播种、育苗、移栽、染毒等过程以及营养液配制同上，仅设300 μmol/L CdCl2的处理组。染毒10 d 后，各处理组严格选取正常生长、无明显中毒症状的植株待测。

1.3 测定项目及方法

按常规方法用直尺测量各植株的根长和株高。将采集的各植株用自来水洗净，再以去离子水冲洗，用吸水纸将表面水分吸干后分为根和茎叶2 个部分，称鲜质量；将78-04 和罗勒的各组织置于105 ℃杀青30 min，70 ℃烘至恒质量，称干质量后粉碎过筛，HNO3-HClO4（体积比为4∶1）消化，原子吸收分光光度计测定镉含量。

富集系数（BCF）＝植株组织中Cd 含量/培养液中Cd 含量 （1）

转运系数（TF）＝植株地上部Cd 含量/植株根部Cd 含量 （2）

取各植株的新鲜叶片0.5 g，置于预冷的研钵中，加入50 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH 值7.0）5 mL在冰浴中研磨，4 ℃12 000 r/min 离心20 min，取上清待用。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定；脯氨酸（PRO）含量采用酸性茚三酮比色法测定[15-16]。

1.4 数据分析

数据分析采用Excel 2007 软件；用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 亲本幼苗耐受与富集镉的差异分析

预试验发现，与对照组（0 μmol/L CdCl2）相比，50～100 μmol/L CdCl2胁迫对78-04 烟草与野生罗勒幼苗的正常生长发育没有任何影响；当镉浓度增至200 μmol/L时，仅烟草植株呈现出新叶黄化的轻微毒性症状，去除重金属后仍能正常生长。即使在300 μmol/L CdCl2的胁迫下，罗勒幼苗也能正常生长，表现出了较强的耐受能力；而部分78-04 烟草的叶片严重卷曲、变黄，根、茎生长缓慢，植株萎蔫、失绿，镉去除后几乎不能恢复生长。进一步分析表明，野生罗勒与78-04 烟草对镉的积累量、富集系数和转运系数也存在明显的差异（P＜0.05）（图1）。

2.2 对镉胁迫耐受与生理响应的差异分析

将部分F2种子（120 粒）播种后，其发芽率可达93.3%，以300 μmol/L CdCl2对112 株幼苗染毒后，以株高、根长、生物量（鲜质量）为指标观测幼苗的生长表型。结果显示，在镉胁迫下，F2分离成2 个明显的类群：强耐受型和弱耐受型；其中，108 个植株对该浓度的毒性非常敏感，呈现出典型的中毒症状甚至死亡，但仍有4 个单株对高浓度的镉极不敏感，其根、茎、叶均未见明显的毒害症状，且各单株的株高、根长、鲜质量等性状优于亲本植株（P＜0.05）（表1）。

表1 镉胁迫对亲本及其F2 生长的影响

植物能够通过多种解毒机制耐受镉的毒性，抗氧化和渗透调节是有效的策略之一，MDA 与PRO含量以及SOD 与POD 活性是反映植物抵抗镉胁迫能力的敏感指标。结果表明，亲本烟草与罗勒对镉胁迫的生理响应具有明显的物种间差异（P＜0.05）；与亲本比较，F2优良单株的SOD、POD 活性和PRO 含量的变化显著（P＜0.05），其平均值分别为10.59，16.15 U/mg 和7.49 μg/g，变幅分别 达5.85～18.42，9.25～22.24 U/mg及4.35～11.83 μg/g（图2）。

3 讨论

为提高烟草耐受与富集重金属的性状，国内外大多采取转基因技术[12]，但目前对罗勒的相关基因及其编码蛋白的功能还不清楚。由于受生物种繁殖隔离机制的影响，2 个远缘物种间的杂交往往难以获得成功[17]。基于植物修复的目的，无论是烟草属品种间、种间还是远缘物种间的杂交育种研究，国内外还鲜见报道。植物的高产性状是由多基因控制的性状，对其改良的难度极大；而重金属超积累性状可能只是由少数几个关键基因控制的，那么就有可能利用这些基因对高生物量的植物进行改良[18-21]，这有望选育出修复污染土壤的有价值的新材料。

利用植物净化污染土壤的功效取决于植物吸收和向地上部转运的能力以及对所富集重金属的耐受与解毒能力。通常植物对镉吸收、积累和耐受的特性是受遗传因素严格控制的，且在不同物种、不同基因型和不同品种间存在明显差异[11，22]。研究发现，在水培条件下，罗勒（Ocimum basilicum）与印度芥菜（Brassica juncea）、甘蓝型油菜（Brassica napus）、天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）、紫羊茅（Festuca rubra）等超富集植物的地上部镉含量相似；在污染的土壤，其镉的累积量高于生物量大的作物玉米（Zea mays）。丁香罗勒（Ocimum gratissimum）的镉累积能力还与蕹菜（Ipomoea aquatica）、芜箐（Brassica rapa）等近似，茎叶的累积量超过100 mg/kg[5-7，11-12]。本试验采集的野生罗勒也能够在污染土壤中旺盛生长却未表现出毒害症状，可能与其长期适应生存环境所形成的特殊机制有关。

镉胁迫会导致植物生长迟缓、叶片褪绿、生物量显著降低甚至死亡等毒性效应，根长、生物量的变化能够直接反映植物对镉的耐受性[23]。镉胁迫诱发的活性氧（ROS）产生与清除的失衡，进而导致的氧化应激、生物大分子损伤，被认为是镉产生毒害作用的主要机制之一。植物会启动抗氧化保护和渗透调节等防御机制来避免或减轻氧化损伤，维持植株的正常生长发育[23]。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）是植物清除活性氧自由基最主要的抗氧化酶，SOD 将O2-还原成H2O2，POD 再将细胞内过量的H2O2迅速分解为H2O 和O2，以防止细胞膜脂过氧化；MDA 是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量的高低是衡量细胞自由基代谢水平和氧化损伤程度的敏感指标。脯氨酸（PRO）是水溶性最大的氨基酸，在维持细胞渗透压、清除活性氧自由基等方面发挥着重要作用，其积累可能是植物受到逆境胁迫的一种信号[24]。

本研究显示，亲本野生罗勒符合镉超积累植物的典型特征：地上部（茎和叶）的镉含量达到了临界含量标准（100 mg/kg），其富集系数（BCF）和转运系数（TF）均大于1。与亲本栽培烟草相比，F2优良单株通过增强抗氧化酶的活性、提高渗透调节物质的水平来避免或缓解毒性镉胁迫导致的毒性作用，显示出了较强的耐受性。目前对导致这些差异的分子机制还不清楚，可能与导入野生罗勒基因产生了新的性状有关，这对挖掘和利用野生超积累植物蕴藏的基因资源进行植物修复研究具有重要的价值。