食管鳞状细胞癌患者microRNA-127-3p的表达水平及临床意义

符佳，汪砥，江金琼，刘劲，段华新

（1.湖南省人民医院 肿瘤科，湖南 长沙 410005；2.长沙市中心医院 肿瘤科，湖南 长沙 410004）

我国食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）发病率较高，严重威胁患者生命健康[1-2]。其发病机制复杂，与诸多分子机制有关[3-5]。明确其发生、发展的分子机制，有利于ESCC早期诊断与靶向治疗[6]。有研究表明，microRNA（miRNA）与胚胎发育、器官形成及肿瘤形成关系密切，其中miR-127-3p与乳腺癌、宫颈癌等肿瘤形成密切相关[7]。有研究表明SKI基因是miR-127-3p潜在的靶基因，但在ESCC中鲜有报道[8]。因此，本研究探讨ESCC患者癌组织中miR-127-3p及SKI蛋白表达水平与肿瘤分期、患者预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年2月—2015年2月于湖南省人民医院和长沙市中心医院行外科手术的ESCC患者80例。其中，男性52例，女性28例；平均年龄（57.1±7.6）岁。患者均未合并影响生存的重大疾病，术中取适量切除的癌组织及癌旁组织（距癌组织≥5 cm正常食管上皮组织），放置于液氮中保存。ESCC诊断最终经病理证实且分化程度明确。参照2009年第7版国际抗癌联盟TNM分期标准[9]，其中Ⅰ期患者22例，Ⅱ期患者31例，Ⅲ期27例；淋巴结转移21例，无淋巴结转移59例。本研究经医院伦理委员会批准，受试者均自愿签署知情同意书，并对患者随访至2018年2月。

1.2 试剂与仪器

DMEM培养液（美国Gibco公司），0.25%胰酶（美国Invitrogen公司），ALP活性检测试剂盒（南京建成生物工程有限公司），二氧化碳CO2细胞培养箱（德国HeraeusHolding公司），Olympus倒置显微系统（TH4-200，南京天龙光电仪器厂），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）仪（LightCycler480，德国罗氏诊断有限公司），TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒（美国应用生物系统公司）。

1.3 细胞复苏及培养

本研究中使用的ESCC细胞株Eca109、Kyse150及正常食管上皮细胞Het-1a均购自中国科学院上海细胞库。由液氮罐中迅速取出冻存的细胞，37℃水浴锅解冻，接种于一次性细胞培养瓶（25 cm2）中，加入 5 ml DMEM 培养液，放入 37℃培养箱在 5% CO2条件下培养，换液频率为2 d/次。当贴壁细胞汇合度达到约90%时，用0.25%胰酶消化传代，计数细胞后按1×105个/ml浓度接种继续培养，将传至第3～5代的细胞进行诱导分化实验。

1.4 RNA 提取

1.4.1 组织中提取由液氮中取出食管癌患者组织，加入研钵中，迅速磨成粉末状；取出100 mg新鲜研磨的粉末加入含1 ml Trizol裂解液的EP管中，混合均匀。室温静止5 min，加入200μl氯仿，充分混匀后室温放置 10 min ；4℃、3 500 r/min 离心 15 min，取上层水相，装于含1.5 ml RNase-free水的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置于冰上30 min；取出离心管，4℃、3 500r/min 离心 15 min，得到 RNA 沉淀 ；75% 酒精500μl洗涤RNA，沉淀2次，风干；加入RNase-free的水50μl，室温溶解RNA；NanoDrop测定RNA浓度，置于-20℃条件下备用。

1.4.2 细胞中提取对各组细胞予以 0.25% 胰酶消化，将消化后的细胞悬液置于15 ml离心管中；在4℃、500 r/min低速离心2 min，弃上清，放置冰上；滴入1 ml Trizol裂解液重悬，混匀细胞，放置冰上；向Trizol裂解液中加入200μl氯仿，剧烈震荡细胞悬液，室温放置 5～10 min，在 4℃、3 500 r/min 离心 15 min ；取上层水相，装入含 1.5 ml RNase-free水的离心管中，放入等体积异丙醇，混匀后，放置冰上30～35 min ；在 4℃、3 500 r/min 离心 15 min，获取RNA沉淀；75%酒精500μl洗涤RNA沉淀2次，风干；放入50μl RNase-free水，室温溶解RNA；NanoDrop测定RNA浓度，置于-20℃条件下备用。

1.5 qRT-PCR

参考 TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒说明书进行操作，对抽提的RNA进行体外逆转录实验，得到cDNA产物。反应条件：16℃孵育 30 min，42℃孵育 30 min，85℃加热 5 min，4℃保存。以得到的cDNA为模版，予以qRT-PCR，采用 TaqMan® Universal PCR Master Mix 20 μl反 应 体系，在PCR仪上操作，以U6作为表达检测的内参，ΔCT表示miR-127-3p的相对表达，其中ΔCT=CTU6-CTmiR-127-3p，反应条件 ：95℃预变性 10 min，95 变性15 s，60℃退火 30 s，70℃延伸 30 s，共40个循环。见表1。

1.6 免疫组织化学染色检测 SKI蛋白

对石蜡切片进行2次脱蜡过程，对脱蜡后的组织进行酒精梯度清洗：二甲苯孵育5 min，弃去二甲苯，加入新的二甲苯继续孵育5 min，无水乙醇洗涤3 min，无水乙醇Ⅱ洗涤3 min，95%乙醇洗涤3 min，80%乙醇洗涤 3 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）洗涤 3次，3 min/次 ；将切片至于含0.01 mmol/L的柠檬酸缓冲液中，对切片进行恢复，并放入微波炉，加热15 min，冷却至室温；取出石蜡切片，置于含3%双氧水中10～15 min，以防止内源性过氧化物酶对切片组织的损伤，用1×PBS缓冲液冲洗3次，3 min/次；按照1∶500加入SKI抗体，对石蜡组织切片进行室温孵育1 h或者4℃孵育过夜，用1×PBS缓冲液冲洗3次，3 min/次；按照1∶1 000加入辣根过氧化物酶标记的二抗，对石蜡组织切片进行室温孵育40 min，用1×PBS缓冲液冲洗3次，3 min/次；加入DAB试剂盒中的显色剂，室温孵育5～10 min，然后清水冲洗；苏木精复染室温孵育3～5 min，清水冲洗；对染色后的切片进行梯度酒精水化处理，然后树胶封片观察。采用上述同样的操作方法，对组织切片中的SKI进行免疫组织化学染色。同时以1×PBS缓冲液为一抗进行孵育，作为免疫组织化学染色的阴性对照。对每张切片随机选取5个高倍镜视野（400倍），计算SKI蛋白阳性细胞所占总细胞数目的比例，阳性表达的细胞数目＞10%为阳性，＜10%为阴性。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各细胞系中 miR-127-3p 相对表达量比较

Het-1a细胞中miR-127-3p相对表达量为（3.04±0.78），Eca109 为（2.38±0.53），Kyse150 为（1.42±0.51），经方差分析，差异有统计学意义（F=5.506，P=0.000）；Het-1a高 于 Kyse150（P＜0.05），Eca109高于 Kyse150（P＜0.05）。见图1。

图1 各细胞系中 miR-127-3p 相对表达量比较（±s）

2.2 食管鳞癌与癌旁组织miR-127-3p相对表达量比较

食管鳞癌组织中miR-127-3p相对表达量为（0.86±0.23），癌旁组织为（1.84±0.35），经t检验，差异有统计学意义（t=11.547，P=0.000），癌组织高于癌旁组织。见图2。

图2 食管鳞癌与癌旁组织miR-127-3p相对表达量比较（±s）

2.3 食管鳞癌与癌旁组织 SKI蛋白表达的比较

患者癌组织及癌旁组织中SKI蛋白主要表达于细胞质。食管鳞癌中SKI蛋白表达阳性率为78.75%，阴性率为21.25%，癌旁组织中阳性率为13.75%，阴性率为86.25%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=67.982，P=0.000），癌组织高于癌旁组织。见图3。

图3 SKI蛋白光镜图（免疫组织化学×400）

2.4 不同临床指标患者的miR-127-3p低表达率比较

不同临床分期患者miR-127-3p低表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ⅲ期高于Ⅱ期和I期。是否有淋巴结转移和饮酒史患者miR-127-3p低表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），有淋巴结转移和饮酒史患者较高。见表2。

表2 不同临床指标患者的 miR-127-3p 低表达率比较 %

2.5 食管鳞癌患者 miR-127-3p 的表达与预后

42例食管鳞癌患者癌组织miR-127-3p低表达，38例患者高表达。20个月时miR-127-3p低表达患者生存率为47.6%，高表达患者为73.7%，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.946，P=0.026）。miR-127-3p低表达患者中位无进展期（20个月）短于miR-127-3p高表达患者（30个月）。见图4。

图4 癌组织中miR-127-3p表达水平与食管鳞癌患者预后的关系

3 讨论

我国食管癌发病例数占全球一半以上，为食管癌高发国家，目前miRNA与食管癌关系的研究日益深入[10]。miRNA在食管癌中的表达存在差异，并且能调节食管癌的增殖、凋亡、侵袭及迁移等生物学特性，这些证据表明miRNA参与食管癌发生、发展等病理过程[11-12]。对miRNA与食管癌关系的研究，目前主要集中在 miR-21、miR-203、miR-375、miR-106b-25、miR-143及miR-196a等的异常表达[13]。王江峰等[14]研究结果提示在84例食管鳞癌组织中，相比于癌旁组织，癌组织中miR-29b低表达48例，正常表达28例，而高表达只有8例；进一步分析发现癌组织中miR-29b低表达的患者，其肿瘤浸润程度低，TMN分期早，预后效果较好；罗君等[15]在食管鳞癌患者组织中检测miR-31的表达发现，其相比正常组织中表达上调，推测其表达上调可能会促进鳞癌发生、发展过程。KURASHIGE等[16]对患者血浆中的miR-21进行检测发现，食管鳞癌患者术后血浆miR-21明显表达下调，暗示其可能与食管癌患者预后相关。赵鑫等[17]通过对在大鼠星形胶质细胞的研究发现，加入脂多糖对大鼠进行诱导，可上调细胞中SKI蛋白的表达，表明其可能参与炎症的发生；JIANG等[18]通过第二代测序技术对miRNAs进行测序，发现miR-127-3p在胶质瘤细胞中表达下调，其表达水平的下调是由于DNA甲基化与组蛋白乙酰化的作用，从而导致基因的转录表达被抑制；对其进一步研究发现，miR-127-3p可通过靶向调控SKI蛋白，激活TGF-β信号的传导过程，抑制胶质瘤细胞的增殖，但对食管鳞癌的研究鲜有报道。

本研究对80例ESCC患者进行miR-127-3p的表达检测,结果癌组织中存在低表达；进一步通过细胞学培养实验发现，miR-127-3p在食管鳞癌细胞中低表达，且在临床分期Ⅰ期中表达最低；分析患者的临床特征与miR-127-3p在癌组织中的表达关系发现，miR-127-3p的表达水平与患者性别、年龄以及吸烟史无关，而与患者食管鳞癌的分期、有无转移及饮酒史相关。表明食管鳞癌组织中miR-127-3p的表达与食管癌的发生有关，其表达上调与食管鳞癌的发展、转移相关，暗示其在食管鳞癌的发生、发展过程中起重要作用；笔者同时对80例患者进行了随访观察，其中42例患者食管鳞癌组织中的miR-127-3p存在低表达，而38例患者食管鳞癌组织中的miR-127-3p相比于癌旁组织变化无差异；绘制生存曲线进行分析发现，高表达miR-127-3p患者中位无进展期长于miR-127-3p低表达患者。

综上所述，在ESCC患者中，相比癌旁组织，癌组织中miR-127-3p存在低水平表达。进一步体外细胞实验验证，miR-127-3p在食管鳞癌细胞中存在低表达，并且与食管癌的发生、发展及预后密切相关。