INPP5E基因影响小鼠胚胎神经管闭合的分子机制研究*

，秦佳星 ，王秀伟 ，官臻 ，牛勃，郭金，王建华，钟儒刚

（1.北京工业大学 环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室，北京 100124；2.首都儿科研究所 转化医学研究室，北京 100020）

肌醇多聚磷酸5-磷酸酶（INPP5E）基因编码INPP5E蛋白，该基因敲除后小鼠出现无脑和露脑的神经管缺陷（neural tube defects,NTD）表型[1-3]。NTD为胚胎中枢神经系统先天畸形，是环境因素与遗传因素复杂交互作用的结果，环境因素包括母体营养、地理及社会经济状况等，而母体叶酸（folic acid,FA）与NTD的发生密切相关[4-8]。FA在体内以四氢叶酸的形式参与一碳单位的代谢，与DNA甲基化过程等表观遗传修饰相关。本研究通过FA缺乏NTD小鼠模型，研究该基因影响胚胎神经管闭合的分子机制，为NTD的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物7～8 周体重 18～20 g 的无特定病原体级C57BL/6J成年健康雌鼠20只（北京维通利华实验动物技术有限公司）。在20～24℃恒温、40%～60%恒湿的条件下，鼠繁殖饲料喂养（北京维通利华实验动物技术有限公司），常规饮水，自由取食。动物房中不定时提供食物和水。本研究已获得首都儿科研究所实验动物伦理委员会的批准（批准号：DWLL2016004）。

1.1.2 试剂和仪器兔源甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、INPP5E单克隆抗体（美国Abcam公司），蛋白上样缓冲液（上海碧云天生物技术公司），脱脂奶粉（美国BD Difco 公司），预染 Marker（美国 Thermo Scientific公司），30%聚丙烯酰胺（上海碧云天生物技术公司），一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），DNA提取纯化试剂盒（德国QIAGEN公司），DNA修饰试剂盒（美国Chemicon公司）。EG1150石蜡包埋机（德国Leica公司），Model200/2.0蛋白质电泳仪（美国Bio-Rad公司），221BR Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell（美国 Bio-Rad 公司），Image Quant LAS 4000mini（美国General Electric 公司），酶标仪（美国 Perkin Elmer公司），7500实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）仪（美国Applied Biosystems公司），多用凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司），超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪（美国Waters公司）等。

1.2 方法

1.2.1 动物模型及标本采集雌鼠体重达 20 g 后，与雄鼠合笼过夜（18:00至次日6:00），次日观察是否出现阴栓，出现阴栓可认为12:00时为胚胎发育第0.5天。

取16只孕鼠，在胚胎发育第7.5天时随机分为对照组和NTD组进行处理，每组8只。对照组腹腔注射0.9%氯化钠NaCl，NTD组采用腹腔注射4.5 mg/kg甲氨蝶呤，干扰FA代谢从而复制NTD小鼠模型[9-10]。在胚胎发育第11.5天颈部脱臼处死小鼠，取胚胎，体视显微镜下观察胚胎畸形情况。

1.2.2 苏木精 - 伊 红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色 将胚胎固定于100 g/L 甲醛溶液中，在乙醇溶液中脱水，在二甲苯溶液中浸泡，之后放入石蜡嵌入包埋，将石蜡块用组织切片机进行神经管组织部位切片，厚度为5 mm，将切片放入二甲苯和乙醇溶液中脱蜡，随后放入苏木精染色液中约10 min，水冲洗后用伊红液浸染3 min，再置于水中洗去浮色。

1.2.3 超高效液相色谱串联质谱法取 20 ml小鼠血浆，加入1.0 g活性炭，冰上轻柔搅拌1 h，4℃、20 000 r/min 离心 5 min，上清为无 FA 小鼠血浆结合酶，分装储存于-70℃备用。第11.5天用提取缓冲液对对照组及NTD组小鼠胚胎神经组织样品进行匀浆。100℃加热提取 15 min，20 000 r/min 离心 15 min，在上清中加入血浆结合酶，将多聚谷氨酸FA分解为小分子的单谷氨酸FA，37℃孵育1.5 h后100℃加热5 min，20 000 r/min 离心 20 min，用超高效液相色谱串联质谱法检测上清液。

1.2.4 重亚硫酸盐测序法在两组小鼠胚胎发育第11.5天采用重亚硫酸盐测序法检测胚胎神经组织中INPP5E基因启动子区DNA甲基化水平。使用DNA提取纯化试剂盒提取基因组DNA于-20℃保存。NTD组DNA采用DNA修饰试剂盒进行重亚硫酸盐处理，将NTD组中未发生甲基化的胞嘧啶（C）转变成尿嘧啶（U），PCR扩增后转化为胸腺嘧啶（T），反之发生甲基化的C无变化。利用UCSC在线查询INPP5E基因 CpG 岛，使用 Methyl Primer Express V1.0软件设计重亚硫酸盐测序法引物，正向引物：5’-GGTTTAGTTATTGGGAAGGAGT-3’，反向引物：5’-AAATTAAACAAAATTAAATCCACCAAA-3’。 扩增产物长度为328 bp，共检测该区域8个CpG甲基化位点。PCR反应体系为50μl，反应条件：95℃预变性 10 min，95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，72℃继续延伸7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，在300 mm紫外灯下观察结果，凝胶成像分析系统记录处理数据，纯化后经Sanger法测序，使用BiQ Analyzer软件进行分析，将C信号的峰高与C+T信号的峰高进行比较，来定量每个CpG二核苷酸位点中的甲基化水平。

1.2.5 Westernblotting 通过 Western blotting 检测INPP5E蛋白的相对表达量。在胚胎发育第11.5天对发育正常小鼠胚胎及发育缺陷小鼠胚胎进行解剖，收集神经组织，用CelLytic MT蛋白裂解液提取正常胚胎神经组织总蛋白，使用布拉德福德光谱蛋白质法测蛋白含量。对蛋白进行SDS-PAGE后取下凝胶，进行电转移，电转移后的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride,PVDF）在10%脱脂牛奶中室温轻摇，封闭1.5 h。将PVDF放入玻璃皿内，加入一定体积稀释的I抗（1∶1 000），4℃过夜。之后用抗鼠II抗（1∶2 000）室温孵育2 h。用增强化学发光液ECL显色，使用影像处理软件分析，GAPDH作为内参蛋白。

1.2.6 qRT-PCR采用qRT-PCR检测两组胚胎发育第11.5天小鼠胚胎神经组织中INPP5EmRNA的相对表达量。20μl PCR 反应液 ：SYBR® Premix DimerEraser™（2×）10μl、PCR 正向引物（10μmol）0.6μl、PCR 反 向 引 物（10μmol）0.6μl、ROX 参比染料（50×）0.4μl、模板 2μl、ddH2O 6.4μl，采用序列分析和熔解曲线分析对PCR产物的特异性进行检验。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性3 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 32 s，共 40个循环，72℃继续延伸 34 s。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验或Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠胚胎表型及 HE 染色结果

对照组小鼠胚胎发育第11.5天胚胎外观较为饱满圆滑，头部前、中及后脑泡均已经发育形成，脊柱表面完整无裂口（见图1A）；可见明显的耳泡、眼泡，尾部弯曲细长。HE染色显示神经管发育良好，细胞排列密集整齐（见图1B、C）。

NTD组小鼠胚胎的后脑部位神经管未闭合，神经组织裸露在胚胎外（见图1D）。HE染色显示后脑顶板未闭合，神经腔面未完整，且细胞排列疏松（见图1E、F）。

2.2 两组小鼠胚胎一般资料比较

两组胚胎的顶臀长度比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=24.480，P=0.002），NTD组短于对照组。两组胚胎的体重比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=41.860，P=0.001），NTD组低于对照组。两组胚胎畸形率比较，采用Fisher确切概率法，差异有统计学意义（P=0.000）。见表1。

2.3 两组INPP5E基因启动子区甲基化水平比较

在引物扩增的328 bp区域中，包含8个CpG二核苷酸。对照组与NTD组CpG甲基化水平分别为40.6%和9.4%，NTD组与对照组甲基化程度的比率为23.2%。两组INPP5E基因启动子区的甲基化水平比较，采用χ2检验，差异有统计学意义（χ2=33.330，P=0.000），NTD组低于对照组。见图2。

图1 两组小鼠胚胎发育第11.5天的胚胎表型及HE染色结果

表1 两组胚胎一般资料比较

图2 INPP5E 基因 CpG 岛的甲基化

2.4 两组小鼠胚胎组织中INPP5E相对表达量比较

对照组和NTD组小鼠胚胎发育第11.5天时INPP5E蛋白相对表达量分别为（1.000±0.230）和（0.482±0.080），经t检验，差异有统计学意义（t=5.981，P=0.027），NTD组低于对照组。对照组和NTD组INPP5E mRNA相对表达量分别为（1.000±0.117）和（0.623±0.034），经t检验，差异有统计学意义（t=7.867，P=0.016），NTD组低于对照组。NTD组小鼠胚胎神经组织中，INPP5E基因启动子区的低甲基化可能是引起INPP5E mRNA表达降低的原因，从而影响胚胎神经管的发育。见图3、4。

2.5 两组小鼠胚胎神经组织中FA及其相关代谢产物水平比较

在最佳的超高效液相色谱条件下分离检测FA及其相关代谢产物5-甲基四氢FA（5-methyltetrahydrofolate,5-MeTHF）、5- 甲酰四氢 FA（5-formyltetrahydrofolate,5-FoTHF）和同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）水平，分别在2.82、2.53、2.88和0.71 min被洗脱，进一步通过串联质谱进行定量分析。见图4。

图3 两组小鼠胚胎组织中 INPP5E 蛋白和mRNA 表达水平比较（n =8，±s）

图4 FA及其相关代谢产物质谱多反应监测色谱图

FA在对照组及NTD组中的含量分别为（2.76±0.98）和（4.39±1.41）mg/g，5-MeTHF的含量分别为（9.55±2.38）和（4.62±1.98）mg/g，5-FoTHF的含量分别为（4.86±1.02）和（3.19±0.75）mg/g，Hcy的含量分别为（4.33±1.42）和（7.06±1.38）mg/g。两组小鼠胚胎神经组织中FA、5-MeTHF、5-FoTHF及Hcy水平比较，经t检验，差异有统计学意义（t=6.566、21.350、10.710 和118.200，P=0.022、0.002、0.009和0.000），NTD组小鼠胚胎神经组织中FA和Hcy水平高于对照组，NTD组小鼠胚胎神经组织中5-MeTHF和5-FoTHF水平低于对照组。见图5。

图5 两组小鼠胚胎神经组织中FA及其相关代谢产物水平比较（n =8，±s）

3 讨论

INPP5E基因调节肌醇信号通路活性，参与胚胎神经发育，其编码的INPP5E蛋白存在于神经细胞的细胞质、细胞骨架、纤毛轴丝、高尔基体、高尔基体膜、外周膜蛋白及质膜内侧[11-14]。有研究发现，INPP5E基因突变导致茹贝尔综合征等疾病[15-17]。有研究显示，INPP5E基因表达影响初级纤毛稳定性，进而调控神经管的闭合[18-20]。有学者报道INPP5E基因突变与神经管畸形相关，神经管畸形是纤毛相关疾病的主要表型之一，是一种严重的出生缺陷，是由多种因素导致的神经管部分或完全闭合不全，进而影响神经系统发育[21]。INPP5E基因突变会引起PI（3，4，5）P3和PI（4，5）P2的生成产物减少，并通过改变PI3K信号通路影响细胞增殖、存活、凋亡及初级纤毛稳定性，从而导致后脑畸形及纤毛相关疾病[22-25]。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，参与基因表达调控，影响胚胎生长发育[26]。低甲基化的DNA在有丝分裂中易发生重组，导致基因发生缺失或易位，最终影响基因表达[27]。有研究报道NTD小鼠胚胎中，与细胞增殖相关的Ptch1、Pla2g4a、Foxgl基因的甲基化水平与对照组相比显著降低，且qRT-PCR结果与甲基化水平改变相关，推测甲基化的改变在NTD发生过程中发挥重要作用[28]。本研究采用腹腔注射4.5 mg/kg甲氨蝶呤，干扰FA代谢从而复制NTD小鼠模型，通过检测对照组及NTD组小鼠胚胎中的FA及其代谢产物，发现NTD组小鼠胚胎神经组织的FA含量明显升高，且代谢产物5-MeTHF和5-FoTHF的含量明显降低，说明此时FA代谢呈现紊乱趋势；INPP5E基因启动子区甲基化水平的显著降低，推测FA代谢失衡引起甲基化供体不足，导致INPP5E基因启动子区甲基化水平显著降低，从而影响该基因的正常表达，干扰神经管的闭合。以上结果表明在神经发育早期，需要INPP5E基因在一定水平上表达调控神经管正常闭合。

本研究发现NTD小鼠胚胎INPP5E蛋白和mRNA相对表达量低于正常小鼠。说明INPP5E基因在发育早期影响神经系统发育，本研究结果表明NTD小鼠胚胎神经组织的INPP5E蛋白和mRNA相对表达量下降，参与FA代谢紊乱神经管闭合失败，造成小鼠露脑畸形。INPP5E基因表达水平的改变是否通过PI3K信号通路活性影响初级纤毛形成，其具体机制尚需在细胞内干扰INPP5E基因的表达，如用CRISPR-Cas9基因编辑技术在小鼠胚胎神经干细胞上进行INPP5E基因敲除实验。同时，检测PI（3，4，5）P3和PI（4，5）P2及初级纤毛的形成可进一步研究该基因对胚胎神经发育的影响。

因此，INPP5E基因在调节胚胎神经发育中起重要作用，NTD组小鼠胚胎神经组织中该基因的表达降低，推测由于FA代谢失衡引起甲基化供体不足，使该基因启动子区发生低甲基化，进而引起基因异常表达导致NTD的发生。对INPP5E基因调控胚胎神经发育分子机制的进一步阐明，对神经系统发育缺陷相关疾病的早期诊断及防控具有重要的意义。