一个中国耳聋近亲婚配家系TMIE基因致病性新突变

王淑娟 梁鹏飞 李琼 李薇 王剑 查定军

空军军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科

耳聋是全世界最常见的残疾之一，给社会带来了巨大的经济负担，同时也严重影响了患者及其家人的生活质量。引起耳聋的病因分遗传因素和环境因素，其中遗传因素占60%[1]。遗传性聋具有高度异质性，已报道的与听力下降相关的基因超过130个（http:∕hereditaryhearingloss.org），在我国最常见的耳聋基因是GJB2、SLC26A4、mtDNA 12SrRNA、GJB3四个基因[2]。文献报道TMIE基因为已知耳聋致病基因，是DFNB6的致病责任基因。疾病表现为语前聋。本文通过芯片捕获高通量测序技术，检测出一例TMIE基因变异患者，通过Sanger测序技术对该近亲婚配家系核心成员进行相关位点检测验证，明确了先证者及家庭成员耳聋的病因，为该家系的遗传咨询提供依据。

1 资料与方法

1.1 家系资料

本研究家系的调查由空军军医大学第一附属医院耳鼻喉科完成，对该项目的伦理论证由空军军医大学伦理委员会认可。家系成员居住地为甘肃省，汉族，先证者父母为近亲婚配。本项目对家庭成员进行详细的问询，包括基本信息、先证者耳聋相关病史、既往史、家族史以及先证者母亲孕期身体状况、用药史、外伤史等。患者及其家属对本研究了解并签署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 听力学检查及听力学表型的分析

先证者及核心家系成员进行了纯音听阈检测。观察先证者及其父亲行走姿态，初步排除了共济失调或步态不稳等前庭功能异常的症状。通过询问病史排除了外伤、用药、噪音等风险因素。根据家系调查和听力结果绘制系谱图（见图1）。

图1家系图谱Fig.1 Pedigree map

1.2.2 DNA提取

采集家系中VI:1、V:1、V:5的外周血3ml，EDTA抗凝，康为世纪生物科技公司FlexGen Blood DNA Kit试剂盒提取血液基因组DNA，Nanodrop微量分光光度计测定DNA的纯度和浓度，取适量样本稀释至浓度为100～200ng/µl后，其余-20℃保存。

1.2.3 目标区域捕获测序

应用已知遗传性聋基因捕获试剂盒，对遗传性聋相关基因编码区及附近剪切区的DNA进行靶向测序，包括86个非综合征型耳聋相关基因，46个综合征型耳聋相关基因，20个听神经病相关基因及27个耳聋相关需鉴别诊断基因，部分基因有临床异质性，共计167个基因。具体方法：将基因组DNA用DNA酶切至200～300bp范围的片段准备构建文库。对这些DNA片段按照Illumina的规定进行末端修复及添加Illumina适配元件。经过PCR扩增，生物素标记的单链DNA捕获探针与文库DNA杂交，磁珠吸附抓取目标基因，洗脱纯化富集。获取的基因片段文库加载到测序芯片Flowcell上，在Illumina NextSeq 500测序仪上对167个耳聋相关基因外显子进行高通量测序，此项工作由北京迈基诺医学检验所完成。

数据分析和生物信息学处理按照标准Illumina程序进行。首先进行去除adaptor、低质量reads、短序列等数据预处理。BWA将预处理后的数据与人基因组NCBI37∕hg19进行比较。GATK软件包中的工具检测SNV、SNP和INDEL。ANNOVAR工具对数据进行注释。使用千人基因组频率数据库（https:∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕variation∕tools∕1000genomes）、人类疾病数据库（https:∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕clinvar），DVD 数据库（http:∕deafnessvariationdatabase.org），dbSNP数据库（https:∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕snp）进行筛选、注释。其中SIFT∕PolyPhen2 软件用来预测SNP改变的蛋白是否会影响功能。各个变异位点严格按照ACMG指南进行致病性分析。

1.2.4 突变验证

家系核心成员验证：采用PCR、Sanger测序的方法对家系成员进行变异检测，验证该变异与表型的相关度；引物设计参考人类基因组序列数据库（Gene ID:259236），上游引物：5’-AGGAGATCGAAGCCCGGTAC-3’，下游引物：5’-CTTCACAGCCACTGCCATCC-3’。PCR反应体系：天根生化科技(北京)有限公司的2×Pfu PCR MasterMix(KP201)25µl，上游引物1µl，下游引物1µl，模板1µl，ddH2O 22µl，总体系50µl。PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性 30sec，59℃退火 30sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃再延伸10min后，4℃保存。行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物，由西安擎科生物技术有限公司完成双向测序。家系外验证，分析了53例散发非综合征型耳聋患者的高通量测序结果，并通过Sanger测序方法对100例听力正常的健康个体进行检测以排除多态性位点。

2 结果

2.1 听力学结果

先证者(VI:1)，男，32岁，先天性聋；父亲(V:1)同样为先天性聋，母亲（V:5）听力正常。对先证者核心家系进行纯音测听检测，先证者纯音测听平均听阈：右耳111dB，左耳96dB。根据世界卫生组织1997年耳聋分级标准，先证者及其父亲均诊断为双耳极重度感音神经性聋，纯音听阈结果详见表1。

2.2 高通量测序结果

先证者TMIE检测出c.458_462delAAGGA纯合变异，变异位置位于3’末端附近，示意图见图2。变异信息详见表2。我实验室53例散发患者测序未发现TMIE基因变异。

图2 TMIE示意图[3]，箭头指向致病变异位置Fig.2 Schematic representation of TMIE[3],Arrows point to the location of the pathogenic variant

2.3 Sanger测序验证结果

先证者Sanger测序结果与高通量测序结果一致。按照最靠近3’端法则，先证者明携带TMIE基因c.458_462delAAGGA纯合变异；先证者父亲携带TMIE基因c.458_462delAAGGA纯合变异；先证者母亲携带TMIE基因c.458_462delAAGGA杂合变异。详见图3。100名听力正常人检测结果为阴性。c.458_462delAAGGA导致终止密码子丧失p.K153Rfs*115引起蛋白质长度变化。根据ACMG指南PM2+PM3+PM4+PP1+PP4，该变异初步判定为致病性变异。PM2：数据库未发现的变异（或隐性遗传病中极低频位点）；PM3：隐性遗传病，此位点为纯合变异；PM4：非重复区框内插入∕缺失或终止密码子丧失导致的蛋白质长度变化；PP1：突变与疾病在家系中共分离；PP4：变异携带者的表型或家族史高度符合某种单基因遗传疾病。

图3家系成员的Sanger测序结果Fig.3 Sanger sequencing results of family members

3 讨论

TMIE基因是一种内耳跨膜蛋白，位于3p21.31，共包括4个外显子，编码156个氨基酸、约17kDa的蛋白，由两个跨膜结构域和一个细胞外的环构成。2002年Naz等[4]根据Mitchem等[5]的动物实验结果，在重度及极重度语前聋DFNB6家系的患者中检测到TMIE基因致病性变异，表明TMIE基因与人类耳聋相关。通过酵母双杂交筛选，TMIE蛋白被鉴定与PCDH15和TMHS相结合[6]，进一步的研究显示TMIE蛋白位于纤毛的顶端与PCDH15的剪接变异体(PCDH15-CD2)结合形成复合体，这个复合体与毛细胞的机械能转换为生物电能的转导机制相关[6,7]。在Tmie缺陷耳蜗毛细胞中，即使尖端，也不能检测到电流[6]。TMIE蛋白的羧基端片段包含与PCDH15相互作用的结构域，过度表达TMIE蛋白的羧基端片段会扰乱TMHS∕LHFPL5的转导[6]。

表1 家系核心成员纯音听阈结果Table 1 Audiometry findings

表2高通量测序结果分析Table 2 Analysis of next-generation sequencing

本研究中的变异位点c.458_462delAAGGA，在人群中的携带率极低，检出者是无任何临床表现仅携带单杂合变异的听力正常人。在本研究发现此变异靠近3’末端，造成终止密码子丧失引起了开放阅读框的改变造成蛋白质长度改变，原本156个氨基酸的肽链延长至268个氨基酸，肽链延长了71.8%，致病性未见报道。经该家系验证分析，先证者及先证者之父为极重度感音神经性聋且该位点纯合变异；先证者之母听力正常该位点杂合变异。根据ACMG指南判定该位点为致病性变异。推测此变异引起的开放阅读框的改变影响了TMIE蛋白的羧基端与PCDH15的互作，造成机械能与电能转导异常引起耳聋，具体此变异导致耳聋的机制需要进一步的研究。该变异的检出将有助于TMIE蛋白的功能分析和耳聋的基因诊断。

除了本研究的变异之外，目前TMIE基因共明确11种致病变异，包含7种错义变异、2种移码变异、2种剪切位置变异。其中移码变异均造成了截短蛋白，这与本研究中的延伸蛋白是不同的。已知报道的TMIE基因变异主要被发现在土耳其[8,9]，巴基斯坦[10]、印度[3,11]、约旦[10]等南亚和中东地区的遗传性聋患者中，2009年刘玉和教授进行流行病学调查时在汉族人群中检测了123例散发非综合征型聋患者、62例遗传性非综合征型聋家系先证者、以及健康对照60例，并未发现TMIE基因致病变异[12]。台湾地区检测了250例患者人中一人携带了致病变异[13]。本研究是首次在中国人群中筛查到TMIE基因c.458_462delAAGGA纯合变异，并首次明确了此变异为致病性变异。在53例散发耳聋患者中未检测到TMIE变异，100例正常人群检测此位点为阴性，这说明TMIE基因变异具有一定的地域性，并不是我国耳聋患者的高发致病基因。本项目的发现在丰富TMIE基因致病变异谱的基础上，也更加印证，中国耳聋患者致病基因的异质性，有更多的工作值得我们进行深入的研究。

综上所述，本研究通过靶向二代测序和Sanger测序相结合的方法，为一近亲婚配的表现为常染色体隐性遗传性聋家系明确了致病基因，探讨了耳聋芯片在临床上应用的方法，对于突变基因的筛选、确定及临床遗传咨询提供了方法和依据。随着高通量测序技术的不断改进和检测成本的降低，该技术将在致病基因鉴定和遗传变异检测中发挥更大的作用。