胆红素对离体小鼠耳蜗组织毒性作用的研究

2019-10-24徐浩林昶

中华耳科学杂志 2019年5期

徐浩林昶

1福建医科大学附属协和医院耳鼻咽喉头颈外科（福州350001）

2福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科，福建省耳鼻咽喉研究所（福州350005）

高胆红素血症是新生儿常见疾病，生理性黄疸对于新生儿是具有保护作用的。但随着胆红素浓度的升高，会出现病理性黄疸，从而造成神经系统损害。听觉传导通路是中枢神经系统中对于胆红素毒性最敏感的部分。大量的观察性实验表明高胆红素血症和听觉系统损伤有很大的关系[1-3]。胆红素导致螺旋神经节细胞密度降低和听神经的髓鞘神经纤维减少[6,7]。核黄疸大鼠研究发现，胆红素主要破坏耳蜗螺旋神经节，造成螺旋神经节神经元发生严重的变性，并且破坏表面附有髓鞘的听神经纤维，而内毛细胞和外毛细胞无形态学改变[4]。目前认为氧化应激是胆红素引起神经损伤的机制之一。非结合胆红素（Unconjugated bilirubin，UCB）会干扰神经元正常的氧化还原状态，使细胞内的活性氧自由基ROS、脂质过氧化产物、蛋白氧化产物都明显升高[5]。

本研究用含不同浓度的胆红素培养基离体培养新生小鼠耳蜗组织，探索其浓度与耳蜗损伤的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物新生5天的C57BL∕6J小鼠30只，SPF级，体重(2.00±0.30)g，雌雄不限，由福州吴氏实验动物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 耳蜗组织取材及培养[13]

将出生5天的C57BL∕6J小鼠引颈处死，解剖显微镜下将耳蜗完整取出，用游丝镊挑开骨性蜗壳，暴露膜迷路，去除螺旋韧带及血管纹，顺序从底转到顶转将基底膜组织与蜗轴分离，得到带有螺旋神经节和柯蒂氏器的耳蜗基底膜组织；移入含无血清DME∕F12培养基液的35mm培养皿上，置于37℃含5%CO2的培养箱中孵育48h。每24h，更换培养基。

1.2.2 胆红素不同浓度的作用

选择生长良好的耳蜗组织，共40个，将其随机分为四组。实验组：25μmol∕L胆红素组、50μmol∕L胆红素组、100μmol∕L胆红素组，各实验组加入相应的胆红素溶液使其达到相应的终浓度；对照组加入等体积生理盐水。避光培养24小时终止培养，4%多聚甲醛溶液固定。

1.2.3 免疫荧光染色

0.01M PBS清洗5min×3次，加入一抗myosinⅦa（1：200，Proteus BioSciences公司），4℃孵育12h；0.01M PBS清洗10min×3次；加入一抗NF-200（1：200，Abcam公司），4℃孵育12h；0.01M PBS清洗10min×3次，加入alexa fluor 488标记的羊抗鸡二抗（1：200，Thermo公司），避光常温孵育1h,0.01M PBS清洗10min 3次,加入alexa fluor 568标记的驴抗兔二抗（1：200，Thermo公司），避光常温孵育1h；0.01M PBS清洗10min 3次。共聚焦显微镜观察（LSM780，Zeiss公司）。

1.2.4 统计学分析

螺旋神经节的神经纤维及内外毛细胞统计:每个标本随机选取宽度为100μm的中回组织进行内毛细胞（Inner hair cell，IHC）和外毛细胞（Outer hair cell，OHC）与螺旋神经节神经纤维（Nerve fibers，NF）计数，数据统计完成后以x±s表示，并用SPSS19.0软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生小鼠耳蜗基底膜培养及免疫荧光染色

新生5天小鼠的耳蜗组织体外培养48小时，在倒置显微镜下观察，可见透亮的毛细胞，结构完整，排列紧密，生长良好，根据形态，能清楚的分辨出一排内毛细胞和三排外毛细胞（图1）。免疫荧光染色后，通过激光共聚焦显微镜观察，可见一排内毛细胞和三排外毛细胞被染成红色，内毛细胞呈窄口宽底的烧瓶状，外毛细胞呈上下均大的圆柱状；螺旋神经节的神经纤维被染成绿色，神经纤维密集，排列整齐（图2）。

图1 倒置显微镜观察耳蜗组织：×400，IHC：内毛细胞；OHC1：第一排外毛细胞；OHC2：第二排外毛细胞；OHC3：第三排外毛细胞。Fig.1 The cochlea tissue was observed by an inverted microscope:×400，IHC：Inner hair cells;OHC1：outer hair cells in the first row;OHC2：outer hair cells in the second row;OHC3：outer hair cells in the third row.

图2 激光共聚焦显微镜观察耳蜗组织免疫荧光结果：×400，NF：神经纤维；IHC：内毛细胞；OHC1：第一排外毛细胞；OHC2：第二排外毛细胞；OHC3：第三排外毛细胞。Fig.2 The cochlea tissues stained by immunofluorescence were observed by laser confocal microscopy:×400，NF：nerve fiber;IHC：Inner hair cells;OHC1：outer hair cells in the first row;OHC2：outer hair cells in the second row;OHC3：outer hair cells in the third row.

2.2 胆红素对耳蜗组织的毒性作用

2.2.1 胆红素对螺旋神经节的神经纤维的作用

经统计学分析后发现，各胆红素组的神经纤维数与对照组的神经纤维数之间的差异有统计学意义（P＜0.05），且各个实验组之间的神经纤维数之间的差异有统计学意义（P＜0.05）（图3、4）（表1）

图3激光共聚焦显微镜下不同浓度胆红素处理后的螺旋神经节的神经纤维、内毛细胞及外毛细胞的生长情况，×400。Fig.3 The growth of nerve fibers of spiral ganglion,inner hair cells and outer hair cells treated with different concentrations of bilirubin under a confocal laser microscope，×400.

图4不同浓度胆红素处理后的螺旋神经节的神经纤维数量；*表示该组与对照组之间的差异有统计学意义；#表示组间差异有统计学意义。Fig.4 The number of nerve fibers in the spiral ganglion treated with different concentrations of bilirubin;*indicates that the difference between this group and the control group is statistically significant;#indicates that the differences between groups are statistically significant.

2.2.2 胆红素对耳蜗毛细胞的作用

各胆红素组的内外毛细胞数与对照组的内外毛细胞数之间的差异无统计学意义（P＞0.05），且各胆红素组之间的毛细胞数之间的差异无统计学意义（P＞0.05）（图5、6）（表2、3）。

图5不同浓度胆红素处理后的内毛细胞数量。Fig.5 The number of inner hair cells treated with bilirubin at different concentrations

图6不同浓度胆红素处理后的外毛细胞数量。Fig.6 The number of outer hair cells treated with different concentrations of bilirubin

3 讨论

适宜水平的胆红素对人体是有益的，是人体内一种强有效的内源性抗氧化剂，可有效清除自由基。但过高的胆红素浓度对人体是有害，可对大脑和神经造成不可逆的损害。新生儿黄疸在新生儿时期是很常见的，UCB增高是最常见的形式。总胆红素一般是轻度的一过性增高[9]，对于大多数的婴儿不会造成影响，只有小部分婴儿会出现影响终生的后遗症，以神经系统的功能障碍为多见。胆红素所致的神经功能障碍，是由于中枢神经系统短暂地或者持续地接触胆红素所致的一系列的神经损伤。胆红素所致的神经功能障碍包括核黄疸，急性胆红素脑病和独立的神经通路功能障碍。[10]听觉系统对于胆红素的敏感性是有据可查的，大量的观察性实验表明高胆红素血症和听觉系统损伤有相关。活体高胆红素血症的动物模型目前还不稳定，[1-3]本实验对体外培养的新生5天小鼠耳蜗组织进行药物处理，模拟新生儿黄疸。有研究发现，当胆红素浓度为50μmol∕L时，离体培养的耳蜗组织的神经纤维有明显减少，而内外毛细胞形态完整，数量无明显变化[11]。本文通过改变胆红素浓度，观察这一现象是否有变化。本实验观察到，在25μmol∕L的胆红素浓度下，胆红素对于离体培养的新生小鼠耳蜗组织的神经纤维造成毒性损害，并且随着胆红素浓度的升高，神经纤维的毒性损害逐步加重；而在100μmol∕L胆红素浓度内，胆红素对于离体培养的新生小鼠耳蜗组织的内毛细胞和外毛细胞几乎不造成损害。这一点与临床上观察到的有关听神经病（ANSD）的临床特点相符合。神经元暴露于胆红素，导致氧化应激增加，神经元的复制减少和谷氨酸突触前神经元退行性变[5,12,13]。当暴露于胆红素时，神经支持细胞会产生炎性标记物，从而增加细胞膜和血脑屏障的通透性，导致细胞内的胆红素负荷增加[14,15]。过量的胆红素能引起细胞内的生物大分子破坏增加。随着蛋白质等大分子的破环，细胞会出现肿胀变形和功能障碍，从而导致细胞破裂和凋亡增加。在正常人和动物体内，耳蜗是一个相对密闭的结构，胆红素进入耳蜗的过程会受到各种途径的限制，所以在体外条件下观察到的胆红素与耳蜗组织直接接触所引起的毒性损伤，与活体的胆红素对耳蜗组织的毒性作用存在差异，需要进一步的活体实验验证。可能随着胆红素浓度的进一步增高及时间延长，内外毛细胞也会发生变化，这也需要进一步实验验证。