褪黑素干预动脉性肺动脉高压大鼠的实验研究

杨婉琳，杨德辉，汤瑜昳，易定锋

(解放军联勤保障部队第九二一医院心血管内科，长沙 410022)

动脉性肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一种严重的进行性疾病，其特点是肺血管阻力和动脉压升高，导致右心室肥厚，最终导致右心力衰竭[1]。PAH的病理变化主要包括炎性细胞浸润、平滑肌细胞增殖，进而肺血管收缩、管腔变窄，导致肺血流受限[2,3]。目前关于PAH的治疗主要是对症治疗，以血管舒张为主，但这些疗法只是改善临床症状或延缓疾病的进展，尽管临床医师做出了巨大的努力，但PAH的死亡率仍然居高不下。目前，治疗PAH急需新的方法和更有效的药物[4]。褪黑素(melatonin,MEL)是松果体产生的一种神经内分泌激素，在调节昼夜节律方面发挥重要作用。MEL以对自由基强大的清除能力和高亲脂性而闻名，可以抑制肺组织炎症，降低肺氧化应激标志物水平，增强酶和非酶抗氧化能力，从而减少肺组织损伤[5]，同时，其经济性和安全性两大特点确保了长期的临床应用[6,7]。鉴于此，我们猜想MEL是否对PAH具有潜在的治疗作用，若具有治疗作用，这种作用是否通过抗炎、抗氧化应激来发挥作用？为进一步验证该猜想，我们建立野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的大鼠PAH模型，给予MEL进行干预, 通过观察相关指标的变化规律探讨MEL对PAH作用的机制，旨在为MEL治疗PAH提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

36只健康成年雄性大鼠，180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；MEL购自美国Sigma公司；MCT购自湖南BioRike公司；环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)一抗购自Immunoway公司；免疫组织化学试剂盒购自湖南BioRike公司。

1.2 动物分组

按随机数表法将大鼠分为对照组、造模组(MCT)和干预组(MCT + MEL)，每组12只。造模组和干预组分别按50 mg/kg(2.5 ml/kg)规格腹膜内注射MCT溶液(MCT溶于无水乙醇 + 生理盐水混合液)以制作PAH模型[8]。对照组接受单次腹膜内注射单位等体积溶媒,即2.5 ml/kg。造模后第1～28天，干预组每天予以MEL 10 mg/kg(MEL溶于无水乙醇 + 生理盐水中，使浓度达10 ml/kg)腹膜内注射1次，对照组和造模组每日予以单位等体积溶媒腹膜内注射1次。28 d后到达实验终点，进行相关指标的观察与评估。

1.3 指标检测

1.3.1 平均肺动脉压及右心室肥厚指数 以3 ml/kg的剂量腹膜内注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠。根据参考文献[9-12]中的测压方法，测定平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure,mPAP)。导管测压结束后，处死大鼠，取出心脏，分离右心室(right ventricular,RV)、左心室 + 室间隔(left ventricular + septum,LV + S)，称质量，计算右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index,RVHI)，RVHI=RV/(LV + S)。

1.3.2 HE染色观察肺小动脉形态学变化 取肺组织经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、烤片制作石蜡切片，行HE染色。选取血管直径在50～200 μm的肺小动脉作为观察对象。在400倍光学显微镜下从每个切片中随机选取5条肺小动脉，测量血管壁厚度(vascular wall thickness,WT)、血管外径(vascular external diameter,ED)、血管腔面积(vascular lumen area,IA)、血管总面积(total vascular area,TA)，计算肺小动脉管壁厚度占血管外径的百分比(wall thickness/vascular external diameter,WT%)和肺小动脉血管壁面积占血管总面积的百分比(vascular area/total vascular area,WA%)，WT%=(2×WT/ED)×100%，WA%=(TA-IA)/TA×100%。

1.3.3 免疫组织化学法检测COX-2表达 将肺组织石蜡切片经脱蜡水洗、抗原修复、血清封闭、加一抗、二抗、显色、复染、脱水、透明、封胶一系列免疫组织化学步骤后，在400倍光学显微镜下观察肺小动脉的COX-2阳性表达区域(area of interest,AOI)，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统确定积分吸光度值(integral absorbance value,IA)，并计算单位肺小动脉COX-2阳性表达面积的平均光密度值(average optical density,AOD)，AOD =IA/AOI。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 试验终点3组大鼠存活情况

对照组全部存活，造模组于第24、26天各死亡1只，干预组于第27天死亡1只，大鼠在死亡前均有严重的呼吸困难。

2.2 3组大鼠mPAP和RVHI比较

对各组剩余大鼠进行相关指标观察。mPAP在对照组、造模组及干预组大鼠中的水平依次为(14.30±0.82)、(27.70±2.41)和(20.30±1.89)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，RVHI水平依次为(0.219±0.031)、(0.418±0.093)和(0.297±0.033)。与对照组相比，造模组大鼠mPAP及RVHI水平均升高，差异有统计学意义(mPAP：P<0.001；RVHI：P<0.001)。与造模组相比，干预组大鼠mPAP和RVHI水平均有不同程度的降低，但仍高于对照组，差异有统计学意义(mPAP：P<0.001；RVHI：P<0.001)。

2.3 3组大鼠肺小动脉HE染色及WA%、WT%比较

对照组肺小动脉结构清晰，壁薄均匀，管腔面积大；造模组肺小动脉管壁增厚，管腔狭窄，平滑肌细胞增生、排列紊乱；干预组管壁增厚、管腔狭窄、平滑肌细胞增生情况改善，肺小动脉血管重构情况改善(图1)。WT%在对照组、造模组及干预组大鼠中的水平依次为(24.77±2.46)%、(51.25±5.87)%和(31.46±4.09)%，WA%水平依次为(30.15±4.07)%、(55.49±6.87)%和(39.87±5.11)%。与对照组相比，造模组肺小动脉WT%及WA%均增加，差异有统计学意义(P<0.001)。与造模组相比，干预组肺小动脉WT%和WA%均显著降低，但高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.001)。

2.4 3组大鼠肺组织COX-2表达比较

免疫组化结果显示肺小动脉内皮及平滑肌细胞胞质中COX-2蛋白表达呈棕黄色，肺小动脉平滑肌细胞核呈蓝色。对照组肺小动脉未见明显COX-2蛋白表达，管壁较薄、管腔面积大；造模组肺小动脉可见大量深棕黄色COX-2蛋白表达，且管壁增厚、管腔狭窄；干预组COX-2蛋白表达减少，管壁增厚、管腔狭窄情况改善(图2)。COX-2在对照组、造模组及干预组的表达水平分别为(0.248±0.059)、(0.629±0.098)和(0.406±0.062)。相比对照组，造模组大鼠肺小动脉COX-2表达量增加，差异具有统计学意义(P<0.001)。给予MEL干预后，相比于造模组，COX-2蛋白的表达水平显著下降，但较对照组仍相对较高，且差异均有统计学意义(P<0.001)。

2.5 COX-2表达与mPAP、RVHI、WT%、WA%的相关性分析

大鼠肺组织中COX-2的表达水平与mPAP、RVHI、WT%及WA%呈正相关(r分别为0.836、0.749、0.823、0.821，P均<0.01)。

3 讨 论

近20年国内外研究者为开发有效的PAH治疗方法做了大量的努力。目前治疗PAH主要是通过影响血管收缩的病理改变，达到促进血管扩张、改善疾病症状的效果[13]。但这些疗法不能阻止疾病的进展或逆转疾病进程，因大多数患者仍然死于该病或对药物治疗反应不足，导致5年生存率仅为59%，即对死亡率的影响非常有限。鉴于此，临床上迫切需要新的药物来更好地治疗PAH[14]。研究认为，PAH发病是血管收缩、血管重塑、炎症等多种因素相互作用的结果[15]。因此，越来越多的相关研究涉及到PAH发展的分子途径，其中炎症被认为是PAH血管重塑的重要因素[16,17]。肺血管受损时会产生大量的炎症介质并招募炎症细胞，后者能持续性地释放包括生长因子在内的炎性细胞因子，促进肺组织中的胶原沉积、平滑肌异常增殖和肺血管收缩的重塑，从而增加肺血管阻力[18]。

图1 各组大鼠肺小动脉形态学变化

图2 各组大鼠肺组织COX-2表达情况

MCT诱导的PAH大鼠模型是目前最常用的PAH建模方法之一，该建模方法引起的大鼠肺组织病理改变与临床PAH相似[18]。本研究旨在探讨MEL对MCT诱导的PAH治疗效果及对COX-2表达的影响，结果证实腹膜内注射MEL对大鼠PAH模型的形成具有显著抑制作用。有研究表明，MEL能够抑制氧化应激、减轻炎症反应和细胞凋亡[19]。MEL在氧化应激和炎症反应中是一种强大而有效的自由基清除剂，可以通过降低氧化应激保护细胞、组织和器官免受氧化损伤，并部分逆转纤维化，且不具有毒性或诱变作用。具体机制可能为MEL作为抗氧化剂可以保护线粒体和核DNA，降低氧化应激水平，抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖，缓解肺动脉高压[20]。

在这项研究中，我们的结果发现MEL干预可以降低mPAP及RVHI水平，提示其对减少心肺损伤程度具有一定作用。免疫组织化学法证实肺小动脉WT%和WA%有所改善，提示肺组织炎性浸润及肺动脉平滑肌细胞增殖程度有所下降。COX-2作为一种常见的炎症介质，很少在正常上皮细胞中表达，但在发育不良细胞和癌细胞中表达量较高，尤其在炎性细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞中均存在一定程度的表达[21]。本研究结果发现COX-2蛋白在造模组肺组织中的表达显著高于对照组，经MEL干预后，水平显著下降。相关分析发现，COX-2的表达水平与mPAP、RVHI、WT%及WA%均呈显著正相关，这些就提示，MEL可能是通过抑制炎症反应和下调COX-2表达来减弱肺血管重塑。

综上所述，MEL能够降低MCT诱导的PAH大鼠的肺动脉压，改善肺血管重塑，这可能与其能抑制肺组织中COX-2表达有关。尽管本研究只是在动物实验水平上证明了MEL治疗PAH的可行性与有效性，但至少证明了我们实验设计的有效性和MEL对PAH保护的可靠性。首先，MEL具有靶向性强、毒性低、成本低等优点，是近年来研究的热点。其次，昂贵的医疗费用是患者临床治疗依从性差的一大主因，而PAH治疗效果有限在一定程度上可归因于药物不足。因此MEL可能是一种潜在的PAH药物，但仍需进一步研究以明确具体分子靶点介导MEL对PAH的保护作用。