对Zn2+及S2-连续响应的罗丹明B酰肼类荧光探针的研究

杨俊卿，吴芳辉，罗祥瑞，朱海威，余爱民

(安徽工业大学 化学与化工学院，安徽 马鞍山 243000)

Zn2+是生物体内必需的微量元素之一，在人体中主要存在于大脑、胰腺及精细胞中，它是神经信号转导和病理学、金属酶调节、基因转录、免疫功能和哺乳动物繁殖等许多生物学过程中的重要辅助因子[1-2]，生物系统中的Zn2+代谢紊乱与癫痫、糖尿病、婴儿腹泻和阿尔茨海默病有关[3]。同时Zn2+还属于重金属离子之一，锌矿开采、冶炼加工、机械制造以及镀锌等工业均会对环境造成极大污染[4]，因此生态环境、饮用水和生物系统中Zn2+的快速灵敏特异性检测是一个重要的研究课题[5]。近年来，基于生物和环境中重金属和过渡金属离子的荧光探针的设计和开发受到广泛关注[6-9]，但这些分子探针要么结构较为复杂、合成原料价格昂贵，要么合成步骤较为复杂，识别灵敏度不高，应对复杂的生理环境时选择性差。因此，开发新“off-on”型结构简单、水溶性好、灵敏度高、选择性强的荧光探针检测Zn2+仍是当务之急。

另一方面，内源性硫在大鼠、人和牛的大脑中呈现较高的浓度水平时，通常与糖尿病、慢性肾病、唐氏综合征、高血压、肝硬化和阿尔茨海默病等许多疾病[10]有关。迄今为止，已有多种分析方法用于识别和检测生物体内的硫离子，其中样品前处理过程简单、分析仪器价廉、响应迅速的荧光探针技术脱颖而出[11]。

众所周知，罗丹明及其衍生物因荧光量子产率高、产量高、光稳定性好、合成简单、检出限低等优点，已被广泛用作一类重要的荧光和显色传感器[12]。本文利用罗丹明衍生物荧光传感的基本原理，通过两步反应、温和的反应条件、价廉易得的原料，导向性设计合成了光学性能好、结构新颖的荧光分子探针N-(2-羟基-5-氯苯)基罗丹明B酰肼(HCPRH)。研究发现向含该探针的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入Zn2+会使原本无色的罗丹明化合物的内酰胺环打开，从而发射出强烈的荧光并迅速产生颜色变化，可实现裸眼识别Zn2+的效果。根据荧光滴定曲线，获得Zn2+的线性检测范围，进一步研究了探针与Zn2+结合性能以及干扰情况，最后还发现该HCPRH探针在继续加入S2-的情况下，荧光和颜色消失，从而可实现Zn2+与S2-的连续响应，因此该HCPRH分子探针可发展作为具有潜在应用价值的光学传感材料。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Nexus-870傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)，布鲁克Avance Ⅲ HD系列核磁共振(NMR)波谱仪(德国布鲁克公司)，日立F4600荧光分光光度计(日本日立公司)。

5-氯水杨醛、罗丹明B与水合肼均购自阿拉丁公司；无水乙醇购自南京学试剂有限公司；所用化学试剂均为分析纯，使用前未经进一步纯化。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 HCPRH探针的合成

图1 HCPRH探针的合成Fig.1 Synthesis of probe HCPRH

1.3 HCPRH探针的荧光测试方法

所有实验均在室温下进行，采用长度为1 cm，容积为3 mL的石英比色皿在荧光分光光度计上测试。将一定量HCPRH溶于分析纯DMF溶剂中配成50 μmol/L溶液，再加入Zn2+进行荧光滴定实验(激发波长为420 nm)。选择性研究中Zn2+和其它干扰金属离子溶液均采用硝酸盐或醋酸盐配制。HCPRH与Zn2+的结合常数(Ka)按照Benesi-Hilderbrand方程[14]进行测定及计算，结合比采用Job's分析法[15]测定。

图2 HCPRH探针对不同浓度Zn2+的荧光响应Fig.2 Fluorescence response of probe HCPRH to diverse concentrations of Zn2+ in DMFconcentrations of Zn2+(1-17):0,1,2,4,6,8,10,15,20,30,40,50,100,150,200,250,300 μmol/L

图3 HCPRH探针对Zn2+荧光响应的机理Fig.3 Fluorescence response mechanism of the probe HCPRH to Zn2+

2 结果与讨论

2.1 HCPRH探针对Zn2+的荧光响应研究

研究发现，在含有50 μmol/L HCPRH探针的DMF溶液中，缓慢加入Zn2+会使原本在512 nm处几乎无荧光的HCPRH探针在365 nm的紫外灯下发射出强烈的亮黄色荧光，且荧光峰强度随着Zn2+浓度增加不断增大，并由512 nm逐渐蓝移至507 nm，当Zn2+浓度为300 μmol/L时，体系荧光峰强度达到最大，继续增加Zn2+，HCPRH探针的荧光强度反而略有下降(图2)，表明此时HCPRH探针与Zn2+结合已经达到饱和。另外，根据荧光滴定结果发现探针荧光强度变化值(ΔIF=IF-IF0)与Zn2+浓度(c)在10～250 μmol/L之间呈良好的线性关系，线性方程为ΔIF=1.091 67c(μmol/L)+13.802 46(r=0.993 0)，按照3σ/S(σ为空白溶液测定的标准偏差，S为线性方程的斜率)计算得Zn2+的检出限为3.6 μmol/L，满足其微量检测要求。

2.2 HCPRH探针对Zn2+的荧光响应机理研究

2.3 HCPRH探针与Zn2+的结合性能研究

根据荧光光谱数据计算作Benesi-Hilderbrand图[14]，结果显示，HCPRH探针在512 nm处荧光强度差值的倒数(1/(IF-IF0))与Zn2+浓度的倒数(1/[Zn2+])呈良好的线性关系，相关系数(r)为0.998 5，由此计算出HCPRH探针与Zn2+之间结合常数为6.962×103L/mol，由于该数值较大，理论上表明HCPRH探针与Zn2+所形成的产物较稳定，荧光不易猝灭[17]。

图4 HCPRH探针与Zn2+之间的Job's图Fig.4 Job's plot of probe HCPRH and Zn2+in DMF

采用Job法[17]分析HCPRH探针与Zn2+之间的结合比。分别吸取一定量探针与Zn2+溶液(浓度均为1 mmol/L)，保持总体积为100 μL，溶于2 mL DMF溶液中，使用1 cm荧光比色皿中进行测定。结果显示，当Zn2+及探针的摩尔分数均为0.5时，荧光强度变化值达到峰值(图4)，表明HCPRH探针与Zn2+以1∶1的摩尔比配位。

图5 含有Zn2+的HCPRH探针体系对不同浓度S2-的荧光响应Fig.5 Fluorescence response of probe HCPRH containing Zn2+ to diverse concentrations of S2-in DMF concentrations of S2-(1-9):0,1,2,3,4,5,6,7,8 μmol/L

2.4 HCPRH探针对Zn2+荧光响应的选择性研究

2.5 HCPRH探针对Zn2+及S2-的连续响应研究

3 结 论

本文采用简单的两步反应制备了一种新型HCPRH分子探针，并采用多种手段表征了其结构和荧光性能。研究发现，在HCPRH探针的DMF溶液中加入Zn2+会导致其荧光峰强度显著增强，在365 nm 紫外灯下可裸眼观察到原本无色的HCPRH探针迅速转变成亮黄色，且其它可能的共存离子(如Na+、K+、Al3+等)不干扰HCPRH对Zn2+的荧光响应。结合荧光滴定实验结果计算了HCPRH探针与Zn2+之间的结合常数和结合比，并获得了HCPRH探针微量检测Zn2+的线性范围和检出限，最后利用Zn2+与S2-之间的稳定结合能力实现了HCPRH探针对Zn2+和S2-的连续荧光识别，该HCPRH探针可发展作为实时在线识别和检测离子的传感材料。