磷掺杂碳量子点的制备及其在金丝桃苷检测中的应用

2019-10-23刘荔贞李海红

分析测试学报 2019年10期

刘荔贞，李海红，冯锋，米智*

(1.山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同 037009；2.山西师范大学化学与材料科学学院，山西临汾 041004)

碳量子点作为一种新型的纳米材料，因具有优异的光电性质、低毒性、好的生物相容性、环境友好性、制备简单和成本低廉等优点[1-2]，受到学术界和工业界的广泛关注，在细胞成像[3]、催化[4]、光电器件[5]和传感[6]等领域得到了广泛应用。目前碳量子点的制备方法主要有自下而上和自上而下两种方法。其中自下而上法主要包括电化学腐蚀法、激光消蚀法、溶剂热解法和电弧煅烧法[7]。自上而下法主要包括水热合成法、超声波法、微波法、模板反应法和自催化法[8]。其中，自催化法是一种简单、快速、高效的碳量子点制备方法，整个合成过程中不需要任何外界条件的辅助。

金丝桃苷(Hyperin，HP)是一种天然的黄酮醇苷类化合物，广泛存在于金丝桃科、桔梗科、杜鹃花科、蔷薇科和葵科等多种植物的果实和全草中。HP因具有消炎、抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁和护肝等多种药理活性[9]而受到广泛的关注，是多种药材质量的评价指标。临床应用结果表明，HP对口腔溃疡、咳嗽、高血压和冠心病等疾病有显著的疗效[9]。因此，对HP进行检测既有重要的理论意义也有临床应用价值。目前，已报道的HP的检测方法主要有高效液相色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、化学发光法[12]和电化学法[13]。然而这些方法操作复杂、分析速度慢、成本高、需要昂贵的仪器设备。相比于其它几种分析方法，荧光分析法不仅快速、成本低，而且具有操作简单、灵敏度高等优点。本文以五氧化二磷和柠檬酸为原料，采用自催化法快速制备了磷掺杂的碳量子点(P-CDs)，并基于HP对该P-CDs的荧光猝灭作用，建立了一种P-CDs检测HP的新方法，将其用于实际样品的分析，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Lambda 35紫外-可见光谱仪(美国Perkin Elmer公司)；F-2500荧光光谱仪(日本日立公司)；Tensor-27傅立叶红外光谱仪(德国布鲁克公司)；X射线光电子能谱(美国赛默飞世尔科技公司)；JEOL-2000EX透射电子显微镜(日本电子公司)。

P2O5(Sigma试剂公司)；金丝桃苷、大豆苷元、阿魏酸、大黄酸、芦丁(中国药品生物制品检验所)；C6H8O7(柠檬酸)、HCl、NaOH、CH3OH、KBr、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O(天津化学试剂公司)；NaCl、KCl、MgCl2、AlCl3、Zn(NO3)2、FeCl3、CaCl2(北京化学试剂公司)。复方木鸡颗粒(丹东制药有限公司)。所有试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 P-CDs的制备

将0.50 g柠檬酸溶于1 mL超纯水中，超声处理30 min后，快速加入盛有2.50 g P2O5的烧杯中，无需搅拌，整个反应过程在通风橱中进行。反应结束后，烧杯冷却至室温，加入20 mL超纯水稀释，将稀释后的液体倒入1 000 Da的透析袋中透析24 h，从透析袋中取出含有P-CDs的溶液，冷冻干燥，得到P-CDs固体产品。

1.3 荧光量子产率的测定

1.4 HP的测定

取0.2 mL P-CDs溶液(1.5 mg/mL)于比色皿中，用磷酸缓冲溶液(pH 8.0)稀释至2 mL,测其荧光强度。然后将不同浓度的HP或样品溶液加入到比色管中，混合均匀后于室温下反应10 min，在280 nm激发波长和390 nm发射波长下测定荧光强度。计算HP对P-CDs的荧光猝灭率(IF0/IF)，IF0为不加HP时溶液的荧光强度，IF为加入HP后溶液的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 P-CDs的表征

图2 P-CDs的IR图Fig.2 IR spectrum of P-CDs

图4A为P-CDs的紫外吸收和荧光光谱图，其紫外吸收在210、300 nm处有宽的特征吸收峰。在最佳激发波长280 nm下，P-CDs在310、390 nm处呈现明显的荧光发射峰，并在紫外灯照射下发出明亮的蓝色荧光(图4A插图)。图4B为P-CDs在不同激发波长下的发射光谱图，从图中可以看出，随着激发波长的增大，P-CDs的发射峰发生红移。以硫酸奎宁为参比，P-CDs的荧光量子产率为5.78%。

2.2 测定条件的优化

2.2.1 P-CDs质量浓度的选择考察了P-CDs质量浓度(0.04～0.23 mg/mL)对荧光猝灭率(IF0/IF)的影响。如图5A所示，随着P-CDs质量浓度的增大，IF0/IF先增大后逐渐减小，当P-CDs为0.15 mg/mL时，HP对P-CDs的荧光猝灭效果最好，所以本实验选择P-CDs的质量浓度为0.15 mg/mL。

2.2.2 pH值的选择考察了在不同磷酸缓冲溶液pH值(2.0～12.0)条件下，HP对P-CDs的荧光猝灭程度。如图5B所示，随着pH值的增加，IF0/IF先增大后逐渐减小，pH 8.0时，HP对P-CDs的荧光猝灭程度最大，因此选择最佳pH值为8.0。

2.2.3 反应时间的选择考察了不同的反应时间对体系荧光强度的影响。如图5C所示，在体系中加入HP后，前1 min，体系荧光强度直线急剧下降，此后，随着时间的增加，荧光强度逐渐减弱，10 min后体系荧光强度几乎无明显变化，故本实验的反应时间选择10 min。

图5 P-CDs的质量浓度(A)和pH值(B)对IF0/IF的影响及反应时间对体系荧光强度的影响(C)Fig.5 Effect of P-CDs concentration(A)and pH value(B) on the IF0/IF and the influence of reaction time on the fluorescence intensity of P-CDs(C)

2.3 P-CDs对HP的选择性

考察了药物中可能存在的其他成分(大豆苷元、阿魏酸、大黄酸、芦丁)和常见金属离子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、Al3+)对测定结果的影响，结果如表1所示。在HP浓度为30 μmol/L，相对误差不超过±5%的条件下，干扰物的浓度10倍于HP时，只有HP能使P-CDs的荧光发生显著的猝灭，其它干扰物对P-CDs的荧光有微弱或者可忽略的影响，对测定结果几乎无干扰。表明P-CDs对HP有好的选择性。

表1 不同物质对P-CDs荧光的影响Table 1 Effects of different substances on the fluorescence of P-CDs

2.4 P-CDs对HP的响应

在最佳实验条件下，考察了HP浓度对P-CDs荧光强度的影响。图6A为加入不同浓度HP后P-CDs的荧光光谱。从图中可以看出，随着HP浓度的增加，P-CDs的荧光发射峰强度逐渐减弱，发生不同程度的猝灭。图6B为P-CDs的荧光猝灭率(IF0/IF)与HP浓度的关系图，如图所示，HP浓度(c)在0.22～55 μmol/L范围内与IF0/IF呈良好的线性关系，线性方程为IF0/IF=0.036 1c+1，相关系数r为0.998 3，以LOD=3S/K(S为10个空白测量的标准偏差，K为标准曲线的斜率)计算检出限(LOD)，该方法的LOD为78 nmol/L。与其它已报道的HP检测方法比较[11,17-19]，本方法具有好的线性范围和高的灵敏度。

2.5 荧光猝灭机理

从图6A中可以看出，随着HP浓度的增大，P-CDs的荧光强度逐渐减弱，同时最大发射波长逐渐红移(从392 nm到440 nm)。从IR和XPS结果可知，合成的P-CDs表面含有大量的羟基和羧基，而HP含有的酚羟基可与P-CDs表面的羟基和羧基以氢键的形式结合，使HP和P-CDs通过氢键作用形成复合结构，从而使P-CDs的表面发生改变，进而导致最大发射波长发生红移[20]。同时，由于碳量子点既是好的电子接受体也是好的电子给予体[21]，电子会从受激发的P-CDs转移到HP的芳香结构上，发生有效的非辐射能量转移，导致P-CDs荧光猝灭[22]。

2.6 实际样品测定

准确称取1.00 g的复方木鸡颗粒，用甲醇溶解并定至10 mL，超声30 min，离心(6 000 r/min)15 min，取上清液测定，同时在未被超声离心处理的样品溶液中加入标准溶液，进行回收率试验，结果如表2所示。由表2可知，其加标回收率为93.3%～107%，相对标准偏差(RSD)为1.5%～1.7%。结果表明该方法具有较高的准确度，可以用于实际样品中HP的测定。

3 结论

本文合成的P-CDs分散性好，粒径为5.0～10.2 nm，表面含有大量的羟基、羧基和含磷官能团，具有良好的水溶性。以P-CDs为荧光探针测定HP的方法简单、快速、选择性好、灵敏度高，并成功用于实际样品复方木鸡颗粒中HP的测定，结果令人满意，为含HP类药物的质控和临床药物检测提供了参考，具有好的应用前景。