基于正交试验法的闪式提取香菇多糖工艺优化
2019-10-23秦令祥周婧琦崔胜文高愿军
秦令祥，周婧琦，崔胜文，高愿军
（1.漯河食品职业学院，河南漯河462300；2.漯河中德双成功能食品研究院有限公司，河南漯河462300）
香菇（Lentinus edodes）是世界第二大食用菌，也是我国特产之一[1]，是一种高蛋白、低脂肪，具有很高食用价值和药用价值的营养保健食品[2]，在我国食用历史悠久，有“菇中之王”，“菌中皇后”的称号[3]。香菇多糖（lentinan，LNT）是从香菇的子实体中分离纯化得到的高分子葡聚糖，主要成分为葡萄糖，是一种生物活性物质，具有提高免疫力和抗病毒等多种生物活性[4-5]，已广泛用于临床治疗[6-10]。
香菇多糖的提取方法目前主要有热水法、酸提法、酶提法、微波辅助法、超声波辅助法等。近年来，闪提法[11]作为一种新的提取技术被应用于多糖的提取，其原理是：在室温和适当的溶剂下，闪式提取器内的物料经高速剪切力、搅拌力和超速动态分子渗透作用，迅速粉碎至细微颗粒，并在局部负压渗透作用下把功效成分迅速扩散到溶剂中，实现功效成分的高效提取。该方法具有省时、节能、高效、环保等优点[12-13]。本文采用闪提法，并用正交试验法优化提取香菇多糖，以期为香菇多糖的提取寻找更加快速、高效的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干香菇：丹尼斯超市；葡萄糖、苯酚、硫酸、无水乙醇（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
JHBE-50S 闪式提取器：北京金鼎科技发展有限公司；UV-2450 岛津紫外可见分光光度计：日本岛津公司；TDL-50B 台式低速离心机：上海安亭科学仪器厂；HH-M4 数显恒温水浴锅：上海赫田科学仪器有限公司；BSA124S 电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；WN-20 万能粉碎机：广州旭朗机械设备有限公司；FRE-52A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DZF-6090 真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 香菇多糖的闪式提取
提取工艺流程：干香菇→粗粉碎（机械粉碎）→闪式提取（以水做溶剂，一定的料液比、提取电压、提取时间和提取次数）→离心（6 000 r/min，10 min）→上清液减压浓缩→加3 倍体积95%乙醇溶液沉淀→4 ℃静置24 h→离心（6 000 r/min，10 min）→真空干燥→即得香菇多糖
1.3.2 香菇多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定香菇多糖的含量。
1.3.3 香菇多糖提取率的计算
香菇多糖提取率根据下列公式计算。
式中：c 为由标准曲线算得的多糖质量浓度，mg/mL；V 为定容体积，mL；N 为稀释倍数；m 为香菇干粉质量，g。
1.3.4 单因素试验
本试验根据预试验结果，选取提取电压、料液比、提取时间和提取次数作为单因素分析对象，每次称取5 份香菇粉进行闪式提取，设定另外3 个因素不变，对其中某个因素进行5 个水平的试验，以香菇多糖提取率为指标进行单因素试验。
1.3.4.1 提取电压对香菇多糖提取率的影响
准确称取一定量的香菇粉样品5 份置于闪式提取器内，料液比 1 ∶25（g/mL），提取时间 90 s，提取电压分别为 120、130、140、150 、160V，提取次数 2次，按 1.3.1方法闪式提取香菇多糖，然后测定并计算其提取率。
1.3.4.2 料液比对香菇多糖提取率的影响
准确称取一定量的香菇粉样品5 份置于闪式提取器内，每份料液比分别为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），提取时间 90 s，提取电压 150 V，提取次数2 次，按1.3.1 方法闪式提取香菇多糖，然后测定并计算其提取率。
1.3.4.3 提取时间对香菇多糖提取率的影响
准确称取一定量的香菇粉样品5 份置于闪式提取器内，料液比 1 ∶25（g/mL），提取电压 150 V，提取次数2 次，提取时间分别为 60、70、80、90、100 s，按 1.3.1 方法闪式提取香菇多糖，然后测定并计算其提取率。
1.3.4.4 提取次数对香菇多糖提取率的影响
准确称取一定量的香菇粉样品5 份置于闪式提取器内，料液比 1 ∶25（g/mL），提取时间 90 s，提取电压150 V，提取次数分别为 1、2、3、4、5 次，按 1.3.1 方法闪式提取香菇多糖，然后测定并计算其提取率。
1.3.5 正交试验
在上述单因素试验的基础上，选取料液比、提取电压、提取时间和提取次数这4 个因素，选取L9（34）设计正交试验，优化闪式提法的最佳工艺。
1.4 数据处理
试验重复3 次，结果为3 次平均值。正交试验数据采用正交设计助手II V3.1 专业版进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 闪式提取香菇多糖的单因素研究
2.1.1 提取电压对香菇多糖提取率的影响
提取电压对香菇多糖提取率的影响如图1 所示。
图1 提取电压对提取率的影响Fig.1 Effect of extraction voltage on the extraction rate
由图1 可知，香菇多糖提取率随着电压的增大而增大，并逐渐趋于稳定，在电压为150 V 时，提取率达到最大为6.65%。电压增大，闪提器内刀头的转速增大，物料被剪切、破碎的程度就越大，多糖就越易溶出，提取率就越大。当电压超过150 V 时，由于提取器的温度随电压增大而升高，一少部分多糖结构破坏或变化导致提取率降低。因此，本研究最佳的提取电压为150 V。
2.1.2 料液比对香菇多糖提取率的影响
料液比对香菇多糖提取率的影响如图2 所示。
图2 料液比对提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ration on the extraction rate
由图2 可知，香菇多糖的提取率随着料液比的减小先增大后变小，在料液比为1 ∶25（g/mL）时，提取率达到最高为6.79%；再减小料液比，提取率呈现下降的趋势。原因可能是，在一定范围内，料液比的减小，物料与溶剂的接触面积增大，多糖的扩散和溶出速率增加，使提取率提高；但料液比过小，物料的浓度降低，液体的传质动力降低，限制了多糖的扩散和溶出，提取率就降低。因此，本研究最佳的料液比为1 ∶25（g/mL）。
2.1.3 提取时间对香菇多糖提取率的影响
提取时间对香菇多糖提取率的影响如图3 所示。
图3 提取时间对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate
由图3 可知，香菇多糖的提取率随着提取时间的增加而增大，并逐渐趋于平衡。随着时间的增加，物料受到剪切、破碎的程度越大，多糖的溶出就越多，提取率就增大。当提取时间为90 s 时，提取率达到最大为6.82%，再进一步增加时间，多糖的溶出也不会增多而趋于平衡。因此，本研究最佳的提取时间为90 s。
2.1.4 提取次数对香菇多糖提取率的影响
提取次数对香菇多糖提取率的影响如图4 所示。
图4 提取次数对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction times on the extraction rate
由图4 可知，第1 次提取后，多糖的提取并不完全，提取率仅为5.48%，第2 次提取后，第1 次未提取完全的多糖会进一步被提取出来，多糖的提取率达到6.71%，当提取次数超过3 次后，多糖基本溶出完全，提取率就会趋于稳定，不再提高，因此，本研究最佳的提取次数为2 次。
2.2 闪式法提取香菇多糖最佳工艺条件的确定
2.2.1 正交试验水平设计
以上述单因素试验为基础，选取料液比、提取电压、提取时间、提取次数为试验因素，选取L（934）进行正交设计，探讨闪式提取法提取香菇多糖工艺的最佳工艺参数。试验水平设计见表1。
表1 正交试验因素水平表Table 1 Factor levels table of orthogonal experimental design
2.2.2 正交试验结果
正交试验结果见表2。方差分析结果见表3。
表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal experimental design
表3 方差分析结果Table 3 The variance analysis results
由上述试验结果分析可知，各因素对香菇多糖提取率的影响大小顺序为：D＞A＞C＞B，由表3 的方差分析结果可知，在显著水平P=0.05 时，提取次数对香菇多糖的提取率影响较大，达到了显著水平，其他因素的影响不显著，经对R 值的分析，闪式提取香菇多糖的最佳工艺条件组合为：D3A2C2B2，即提取次数3 次、料液比 1 ∶25（g/mL）、提取时间 90 s、提取电压 150 V。
2.2.3 验证试验
对通过正交试验得出的最佳工艺条件进行最优化验证试验，3 次平行试验的香菇多糖提取率平均值为6.83%，显著高于其他条件下的香菇多糖提取率。
3 结论
本文采用闪提法提取香菇多糖，可显著提高多糖提取率，该方法具有省时、节能、高效、环保等特点。通过在单因素试验基础上，经正交试验，得到闪提法提取香菇多糖的最佳工艺条件为：提取次数3 次、料液比1 ∶25（g/mL）、提取时间 90 s、提取电压 150 V。在此工艺条件下，香菇多糖的提取率为6.83%。目前，香菇多糖的市场前景非常广阔，提高香菇多糖提取率的研究很有意义。因此，本研究得到的工艺可为香菇多糖的生产和加工提供一种新的途径和参考。
