白蜡对模型小鼠雄激素性脱发的调节作用※

王占娣，李 娴，孙 龙，丁伟峰，冯 颖

(1.中国林业科学院，云南 昆明650233;2.玉溪师范学院，云南 玉溪653100)

雄激素性脱发又称脂溢性脱发，是临床最常见的脱发类型，其致病机制有多种假说，多数学者认为其与雄激素的异常表达及其代谢过程有关[1]，5α-还原酶的活性及其催化生成的二氢睾酮是导致毛发脱落的主要原因[2-3]。目前，针对脂溢性脱发致病机制开发的药物有雄激素受体抑制剂、促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂和5α-还原酶抑制剂3类。这些药物主要作用于雄激素受体或5α-还原酶，调节紊乱的激素水平。白蜡是由白蜡虫半翅目蚧总科白蜡蚧属雄性幼虫分泌的次生代谢物质漂洗加工而成[4]，《集玄方》记载：“头上秃疮，蜡烛频涂，勿令日晒，久则自然生发。”说明白蜡治疗脱发有一定作用。笔者前期研究发现，白蜡能促进脂溢性脱发模型小鼠毛发的生长，但对其治疗脂溢性脱发的机制尚不明确。因此，本文以KM小鼠和人真皮乳头细胞(HFDPC)为模型生物，探讨白蜡对脂溢性脱发模型小鼠体内激素水平、5α-还原酶活性和二氢睾酮诱导的HFDPC生长的调节作用，为白蜡生发产品的开发奠定理论基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 白蜡(四川峨眉白蜡研究所);实验动物：KM小鼠为5周龄雄鼠[成都达硕科技有限公司，证书号：3 cdk(川)2013-24]，室内适应性饲养1周，饲养温度为室温，光照为自然光，饲喂人工饲料，食物和水不限量供应;HFDPC和人毛囊真皮乳头细胞生长培养基(美国Cell Applications公司);丙酸睾酮(杭州动物药品厂);非那雄胺(大连美仑生物技术有限公司);Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(美国Promega公司);灭菌大豆油为食品级大豆油150℃干热灭菌4 h;无水乙醇和1，2-丙二醇为分析级。

1.2 样品制备 丙酸睾酮溶解于灭菌大豆油，浓度为5 mg/m L;非那雄胺用有机溶剂(乙醇∶丙二醇=80∶20)配制，浓度为2%;高级烷醇用有机溶液(乙醇∶丙二醇=80∶20)配制，浓度分别为0.5%、1.0%、2.0%，备用;称取适量T和非那雄胺溶解于95%乙醇中制备成浓度为1 mol/L的T溶液和浓度为10μg/m L的非那雄胺溶液，备用;称取适量乙二胺四乙酸(EDTA)溶解于蒸馏水中，浓度为10 mg/m L，备用。

1.3 动物分组与处理 将36只KM小鼠随机分成6组，每组6只。动物模型的建立参照RENUKA等[5]的报道。6组分别为CK组(不进行任何处理)、模型组(皮下注射丙酸睾酮0.1 m L)、阳性对照组(皮下注射丙酸睾酮0.1 m L加局部涂抹2%非那雄胺0.5 m L)、实验组(皮下注射丙酸睾酮0.1 m L的同时局部分别涂抹5.0%、10.0%和15.0%白蜡0.5 m L)，连续给药60 d。

1.4 激素含量的测定 给药第60日每组随机选3只小鼠，采集心脏血，室温静置30 min，转速3 500 r/min，离心10 min，用一次性注射器抽取上层血清。采用睾酮(T)和雌二醇(E2)酶联免疫试剂盒测定小鼠血液中T和E2的含量。测定样品和标准品的吸光度值，酶标仪波长为450 nm，重复3次。采用Excel表绘制标准浓度与OD值的标准曲线，计算标准曲线的直线回归方程，将样品OD值代入回归方程中计算样品中激素的含量。

1.5 5α-还原酶提取 取4周龄体质量为18～22 g健康的KM小鼠，禁食不禁水，过夜脱颈处死，在冰上提取小鼠附睾，剪碎，称重，加入3倍量预冷均浆液，在玻璃匀浆器中匀浆，匀浆液于4℃、3 500 g离心10 min，离心2次。取上清液，再次于4℃、10 000 g离心50 min，取上清液，分装。保存于-80℃冰箱，用考马斯亮蓝测定蛋白含量。

1.6 白蜡对5α-还原酶的抑制作用 在5 mL的离心管中添加0.1 mL 1 mmol/L睾酮溶液、0.1 mL EDTA水溶液、0.3 mL的5α-还原酶和0.3 mL不同浓度白蜡溶液(浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL)或非那雄胺溶液(浓度分别为0.012 5、0.062 5、0.125 0、0.250 0 mg/mL)，用 20 mmol/L磷酸钠溶液补足到1.5 m L，混合均匀，在37℃培养箱内孵育60 min，加入3 m L乙酸乙酯终止反应。漩涡震荡1 min，3 500 rpm离心10 min，取有机层，蒸干，添加2 m L甲醇。采用高效液相(HPLC)测定T的含量，根据T标准曲线，计算样品反应后溶液中残留的T含量。按照下列公式计算：T反应量=C0min-C60min，C为反应体系中T的量;T转化率=(Mck-M样品)/Mck×100%，M为T的转化量;5α-还原酶抑制率=(Rck-R样品)/Rck×100%。

1.7 白蜡抑制二氢睾酮与受体的结合 采用MTS法测定白蜡对二氢睾酮与受体结合的抑制作用。HFDPC(2.5×103个/孔)接种到96孔板中，贴壁后在每个孔中添加终浓度为1×10-4的二氢睾酮溶液，同时添加终浓度为5、2.5、1.26、0.625μg/m L的白蜡，以0.2μmol/L非那雄胺溶液为阳性对照，只添加T溶液的细胞作为空白对照，每个处理4个复孔，继续在37℃条件下培养48 h。每孔加20μL MTS试剂培养4 h，490 nm测定细胞数量，并计算细胞增殖率。细胞增殖率=(OD处理组-ODCK组或模型组)/ODCK组或模型组×100%。

1.8 统计学方法 采用SAS 9.1统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组计量资料比较采用ANOVA法分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 激素水平比较 白蜡组T含量随着白蜡浓度的增加而增加。给药60 d后，5%、10%的白蜡组T含量明显低于模型组(P＜0.05)，高于阳性对照组(P＜0.05)。10%白蜡组E2含量均明显高于5%、20%白蜡组、阳性对照组和模型组(P＜0.05)，T/E2明显小于模型组(P＜0.05)，大于阳性对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 给药第60 d后各组雄激素性脱发模型小鼠激素比较(±s)

表1 给药第60 d后各组雄激素性脱发模型小鼠激素比较(±s)

注：与模型组比较，△P＜0.05;与阳性对照组比较，▲P＜0.05

组别 只数 T(pmol/L) E2(pmol/L) T/E2 CK组 3 1 337 887.80±11 659.48△▲ 187.49±15.07△▲ 718.13±65.90△模型组 3 154 983.20±13 966.57▲ 179.44±12.76 873.22±97.68▲阳性对照组 3 119 240.80±3 022.49△ 180.64±4.21△ 660.93±24.56△5%白蜡组 3 132 769.50±1 142.05△▲ 179.66±22.75△ 762.23±91.87△▲10%白蜡组 3 139 994.30±3 282.15△▲ 192.41±2.44△▲ 727.77±18.11△▲20%白蜡组 3 154 961.60±11 957.80▲ 172.51±6.69△▲ 897.13±50.95△▲

2.2 对5α-还原酶的抑制作用比较 白蜡和非那雄胺可以明显降低T转化二氢睾酮的能力，抑制5α-还原酶的活性。随着二者浓度的增加，T的反应量和转化率均降低，5α-还原酶的抑制率增加。白蜡和非那雄胺对5α-还原酶的抑制中浓度分别为1.66μg/m L、0.07μg/m L。见表2、表3。

表2 白蜡对5α-还原酶的抑制作用

表3 非那雄胺对5α-还原酶的抑制作用

2.3 白蜡抑制二氢睾酮与受体的结合 随着白蜡浓度的增加，HFDPC增殖率降低。白蜡浓度为0.063 ppm时，对二氢睾酮模型细胞的增殖效果最为明显，其值与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);浓度为1.56 ppm时HFDPC的增殖率明显低于阳性对照组(P＜0.05)，与模型组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);白蜡浓度高于3.12 ppm时，细胞增殖率明显降低，且低于模型组(P＜0.05)。见表4。

表4 白蜡对二氢睾酮模型细胞的增殖作用

3 讨论

文献报道显示，激素水平紊乱是导致雄激素性脱发的主要原因[1，6-7]。T与E2是维持体内激素水平的重要激素，与性别关系密切。对女性而言，T和E2均由机体直接分泌;对于男性而言，T由机体直接分泌，其在芳香酶的作用下可产生E2。正常情况下，T与E2共同维护机体激素水平的平衡。若机体激素水平失衡则会对毛囊的生长造成较大的危害。因此，调节体内T和E2的含量，使其比值维持在正常范围是治疗雄激素脱发的有效措施之一[8]。本实验中，笔者通过测定小鼠体内T、E2的含量，计算T与E2的比值，评价白蜡对激素的调节作用。结果显示，皮下注射丙酸睾酮建立雄激素性脱发模型小鼠，给药60 d后，小鼠体内的T/E2比值明显升高，局部涂抹10%白蜡后小鼠体内T/E2比值明显低于模型组(P＜0.05)，与CK组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明白蜡能调节雄激素性脱毛模型小鼠体内紊乱的激素水平。

雄激素性脱发激素水平的紊乱并不是T直接作用的结果，而是头部大量集聚的T在Ⅱ型5α-还原酶催化下产生的二氢睾酮穿透细胞膜与雄激素性受体结合后，进入毛囊细胞，破坏DNA的表达，诱发HFDPC衰退[9]。有文献报道，抑制5α-还原酶活性及阻止雄激素与受体结合是雄激素性脱发药物作用的靶标位点，某些外源性的物质能抑制5α-还原酶活性，阻止二氢睾酮对HFDPC的伤害[10]。目前国际上公认的治疗雄激素脱发的药物非那雄胺可同时作用于这两个位点[11-13]。本次研究结果显示，白蜡能够抑制5α-还原酶活性，降低T转化率，同时一定浓度范围内还能促进二氢睾酮诱导的HFDPC增殖，其抑制5α-还原酶的浓度高于阳性对照组(非那雄胺)(P＜0.05)，而白蜡用量为0.063 ppm时促进细胞增殖效果与非那雄胺比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明白蜡能够抑制5α-还原酶活性，一定浓度范围内可阻止二氢睾酮与受体的结合，其抑制5α-还原酶活性低于非那雄胺，但一定浓度时其阻止二氢睾酮与受体结合的能力与非那雄胺无差异。

本研究结果显示，白蜡能降低小鼠体内T的表达量。由于雄性小鼠不能直接分泌E2，其由T在芳香酶的催化下生成。由此推测，白蜡对芳香酶的活性或其催化T生成E2的生化过程具有调节作用，但具体作用机制有待进一步验证。

综上所述，白蜡对雄激素及其代谢过程均具有调节作用，其可通过调节紊乱的激素水平，抑制5α-还原酶活性，阻止二氢睾酮与受体的结合，促进雄激素性脱发毛发的生长。