小龙虾疾病的病原检测

宫子慧

近年来，克氏原螯虾（俗称小龙虾）的消费量不断增加，人工养殖面积持续扩大，泗洪县小龙虾的养殖模式主要以稻虾综合种养为主。2018年5月起，我县部分养殖户的小龙虾出现死亡，病虾主要表现为头胸甲易剥离、肝胰腺颜色淡黄、螯肢及附肢无力、反应迟钝、应激能力较弱、在头胸甲部位常出现白斑。笔者通过对病虾肝胰腺的细菌分离及鉴定，和PCR法分子检测技术来探讨引起小龙虾发病的原因。

1 材料与方法

1.1 样本来源

病虾样本来自泗洪县青阳镇、曹庙乡、孙园镇、城头乡等乡镇的6个发病的养殖塘口，样本的采样编号、采集时间及地点见表1。

表1 小龙虾病样采集信息

表2 鉴定试剂条检测结果

表3 2株细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）对照表 mg/L

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离、鉴定及药敏试验

用灭菌棉签蘸取小龙虾肝胰腺，均匀涂于普通营养琼脂培养基上和TCBS培养基上，分别置于28℃、37℃恒温培养18-24h后，观察菌落形态，并挑取可疑单个菌落划线接种在营养琼脂平板和3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上，分别置于28℃、37℃恒温培养18-24h。

挑取纯化过的细菌制成0.5麦氏单位的菌悬液，采用肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）系统测定各分离菌株生理生化特性，同时做氧化酶反应构成第21个试验，并用南京菲恩医疗科技有限公司的动物用药敏分析试剂板进行药敏试验。

1.2.2 WSSV 核酸提取及检测

从病虾中取约100mg鳃组织，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒的说明进行DNA提取，对WSSV DNA样本采用《GB /T 28630.2-2012白斑综合征（ WSD）诊断规程第2部分套式PCR 检测法》为标准进行检测。PCR扩增体系总量为50μL，分别为：25μL Mix Taq酶（ Takara），18μL无菌水，1 μL正向引物，1 μL反向引物，5μL模板。PCR产物通过用50×TAE电泳缓冲液配制的1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

图 3 WSSV PCR检测结果

2 结果

2.1 病原菌的鉴定药敏试验

从小龙虾肝胰腺分离到的细菌在营养琼脂平板上为光滑、湿润、微凸、淡黄色菌落，在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落。对分离的2株细菌进行生理生化检测，结果判定：分别为嗜水气单胞菌和霍乱弧菌，具体生理生化特性见表 2。

2.2 病原菌的药敏试验结果

2株细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度如表3所示。

参照2013年抗菌药物敏感性试验执行标准，嗜水气单胞菌对红霉素为耐药，对其他7种抗菌药物均敏感，霍乱弧菌对红霉素为中敏，对其他7种抗菌药物均敏感。

2.3 WSSV PCR检测结果

PCR检测结果显示病虾WSSV病毒阳性检出率为100%，如图3所示。

M∶DNA Marker（自上到下依次为2000、1000、750、500、250、100bp）；1.阳性对照；2.阴性对照；3.采样编号SH18050301；4.采样编号4SH18050302；5.采样编号SH18050303；6.采样编号SH18050304；7.采样编号SH18060601；8.采样编号SH18060602

3 讨论与分析

从生病小龙虾肝胰腺分离到的2个细菌，根据其培养后的菌体形态特征、生化特性分析结果，分别确定为嗜水气单胞菌和霍乱弧菌。通过药敏试验表明两种菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸环丙沙星、盐酸土霉素、强力霉素均敏感。

PCR结果表明所有小龙虾中都感染了WSSV（白斑综合征病毒）。WSSV为一种无包涵体病毒，地理分布广，流行范围大，传染性强，对发病虾致死时间短，目前尚无有效的治疗药物，还不能有效地控制疫情，因此在小龙虾养殖过程中应加强疾病的预防。控制合理的放苗密度，规格200尾左右/kg的虾苗亩均放养量不超过30kg，苗种健康，养殖过程中加强饲料投喂，提早投喂精饲料，颗粒饲料蛋白含量36%以上，提高虾的抗病力，调控好水质，定期泼洒氯制剂或碘制剂进行水体消毒，移植培育好水草，营造良好的池塘环境，同时每7-10天使用过硫等底改产品改善养殖池底环境，定期内服黄芪多糖等增强免疫力的产品。如果在养殖过程中出现死虾，应认真处理好死亡的病虾，在远离养殖塘处掩埋病虾，杜绝病毒的进一步扩散。