高效液相色谱-荧光检测法测定水果中乙氧基喹啉

余晓琴，李澍才，唐昌云

(四川省食品药品检验检测院，四川 成都 610097)

乙氧基喹啉的化学名为6-乙氧基-1,2-二氢化-2,2,4-三甲基喹啉，又名乙氧基喹或乙氧喹，为淡黄色至琥珀色粘稠液体，沸点为125 ℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。乙氧基喹啉有一定的防霉和保鲜作用，可作为食品防腐剂、水果保鲜剂，以及食品、饮料、油脂及药品等的抗氧化剂[1]。但人体摄入过量乙氧基喹啉会存在损害人体组织器官的潜在风险[2]。

目前已有许多国家规定了食品中乙氧基喹啉的最高残留限量，其中我国GB 2760-2014规定乙氧基喹啉在经表面处理的鲜水果中的最高残留限量为1 mg/kg[3]；美国规定乙氧基喹啉在禽蛋中的限量为0.5 mg/kg，在牛奶中则不允许添加[4]；日本规定植物源性食品中乙氧基喹啉的限量为0.05 mg/kg[5]。为有效控制乙氧基喹啉在食品中的残留量，目前已开发了多种检测方法，国外已报道的测定方法有高效液相色谱-荧光检测法[2]、液相色谱-串联飞行时间质谱法[6]、液相色谱-电化学检测法[7]和稳定同位素液相色谱-串联质谱法[8]等。而国内现行的标准方法和文献方法包括气相色谱法[9]、液相色谱法[10-14]、液相色谱-串联质谱法[15-16]等，其覆盖基质和测定方法均有所不同。但均未综合考虑乙氧基喹啉在检测中的技术难点：SN/T 0533-2016[12]标准方法未关注乙氧基喹啉在酸性水果基质中易离子化而导致提取困难的问题；丁涛等[16]所建方法未关注乙氧基喹啉与水果中自由基发生反应的问题；黄超群等[17]所建方法未关注乙氧基喹啉在浓缩过程中易损失的问题。此外，上述方法多为一次提取，难以保证实际样品测定时的准确度。

本文综合考虑上述关键问题，建立了一种通过抑制乙氧基喹啉的氧化反应，在碱性条件下提取后浓缩测定的高效液相色谱-荧光检测方法。所建方法涵盖多种水果，已通过5家检测机构协作验证，能够满足水果中乙氧基喹啉残留量的监测要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱-荧光检测器联用仪(美国安捷伦公司)；Milli-R04 纯水仪(德国Millipore公司)；乙氧基喹啉标准品(CAS号：91-53-2，纯度≥98%，上海安谱科学仪器有限公司)；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；正己烷、维生素C、氢氧化钠、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、抗坏血酸棕榈酸酯、没食子酸丙酯(分析纯，成都科龙化学试剂厂)。

1.2 标准溶液的制备

准确称取10 mg(精确至 0.01 mg)乙氧基喹啉标准品，用乙腈溶解并定容至10 mL，混匀后转移至玻璃容器中，于-20 ℃保存。精密移取上述溶液适量，用维生素C饱和的乙腈稀释成系列标准工作溶液，质量浓度分别为2、5、10、20、50、100 μg/L，临用现配。

1.3 供试品溶液的制备

取代表性样品500 g，加入10 g维生素C，用组织捣碎机粉碎加工成浆状，混匀。称取5 g(精确至0.01 g)上述样品于50 mL离心管中，加入0.1 mol/L氢氧化钠5 mL，涡旋混匀30 s后，加入10 mL正己烷，涡旋混匀，振荡提取15 min后，以 8 000 r/min离心3 min。将正己烷层转移至25 mL容量瓶中，残渣中再次加入10 mL正己烷，重复提取1次，以 8 000 r/min离心3 min后，合并正己烷层，以正己烷稀释至刻度，摇匀后，精密量取5 mL，于30 ℃氮吹至干，精密加入5 mL乙腈，涡旋，过0.45 μm有机微孔滤膜，滤液待测。对于乙氧基喹啉含量较高的样品，可用乙腈适当稀释后进行测定。

1.4 分析条件

色谱柱为Waters XTERRA C18液相色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm，美国Waters公司)；流动相：乙腈-水(体积比65∶35)；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；荧光检测器激发波长：365 nm，发射波长：435 nm；进样体积：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 仪器分析条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择对比了Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Agilent XDB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters XTERRA C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、ACE 3 C18(2.1 mm×75 mm，3 μm)、安谱Athena C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Thermo Hypersil ODS C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)等色谱柱对待测化合物的分离效果，结果表明以乙腈-水(65∶35)为流动相时，乙氧基喹啉在7种C18色谱柱中均能得到很好的分离，拖尾因子均小于1.05。验证单位(湛江市食品药品检验所、上海市食品药品检验所、常州市食品药品监督检验中心、四川省轻工业研究设计院、中国检验检疫科学研究院综合检测中心)分别使用Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters Symmetry RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、SHIMADZU Inertsil ODS-HL(4.5 mm×250 mm，5 μm)等不同色谱柱对方法进行验证，结果显示普通C18色谱柱均可满足分析要求。本方法选用实验室现有的Waters XTERRA C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱。

2.1.2 流动相的选择比较了乙腈、甲醇作为有机相以及纯水和不同浓度的乙酸铵溶液(5、10、20 mmol/L)作为水相时，不同流动相组成对乙氧基喹啉峰形和响应的影响。结果表明，以乙腈为有机相时，乙氧基喹啉的响应明显优于甲醇，故采用乙腈作为有机相；水相中含有乙酸铵时，对乙氧基喹啉的峰形和响应影响不明显。因此，本研究选择乙腈-水作为流动相，待测化合物可获得良好的色谱峰形和响应，且灵敏度高。为兼顾保留时间和色谱峰形，以及试样中部分极性杂质需要洗脱，最终选择乙腈-水(65∶35)为流动相等度洗脱，乙氧基喹啉的保留时间为7.54 min。

图1 乙氧基喹啉的色谱图(20 ng/mL)Fig.1 Chromatogram of ethoxyquin(20 ng/mL)

图2 抗氧化剂种类对乙氧基喹啉回收率的影响(n=3)Fig.2 Effect of antioxidant type on recovery of ethoxyquin(n=3)

2.1.3 荧光条件的选择乙氧基喹啉的苯环和喹啉环可形成共轭体系，使其具有明显的紫外吸收和荧光性质。由于相比于紫外检测器，荧光检测器具有更高的选择性、灵敏度以及更低的基质和背景干扰，因此本实验选用荧光检测器。分别对乙氧基喹啉的紫外吸收和荧光激发情况进行了考察，用紫外-可见分光光度计扫描190～800 nm范围内的吸收光谱，发现乙氧基喹啉在226 nm和365 nm处有特征吸收峰。选择干扰相对较小的365 nm作为荧光的激发波长，扫描365～650 nm范围内的荧光发射光谱，发现最佳发射波长为435 nm。最终确定荧光检测器的激发波长为365 nm、发射波长为435 nm。在优化条件下，乙氧基喹啉的色谱图见图1。

2.2 供试品溶液制备条件的优化

乙氧基喹啉不溶于水，易溶于有机溶剂，其结构中的仲胺具有一定的接受质子能力，属于一种弱的有机碱[16]，因此乙氧基喹啉在水果基质中易以离子态存在。本实验利用碱性溶液抑制其离子化，再采用正己烷作为提取溶剂，具有较高的提取效率。提取过程中水果中的大量自由基能与乙氧基喹啉快速发生氧化反应，导致方法回收率为0，因此需在前处理过程中加入抗氧化剂，以阻断乙氧基喹啉的氧化反应。

2.2.1 抗氧化剂条件的优化比较了维生素C、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、没食子酸丙酯(PG)4种抗氧化剂在提取过程中对乙氧基喹啉(添加量为0.2 mg/kg)的保护效果。称取5 g粉碎的苹果样品，分别加入上述4种抗氧化剂0.5 g。同时制备橙子样品，同法处理，考察4种抗氧化剂对富含维生素C的水果基质是否造成影响。结果(图2)显示，维生素C和PG的抗氧化效果良好，苹果和橙子样品的回收率均大于80%；BHT由于不溶于水，无法在水溶性的样品基质中发挥抗氧化作用，导致苹果样品的回收率不足10%；AP的水溶性相对较差，因此抗氧化效果比维生素C和PG弱，2种样品的回收率均小于80%。对于橙子等富含维生素C的样品，加入抗氧化剂后对乙氧基喹啉的提取效率影响较小。由于相比于PG，维生素C是一种在水果中天然存在的抗氧化剂，价格低，易获得，因此选择维生素C作为抗氧化剂。

进一步对维生素C的加入量(0.2%、0.5%、1%、2%、5%)进行了考察，结果显示，维生素C的加入量分别为0.2%和0.5%时，乙氧基喹啉的回收率分别为51.8%和78.1%；维生素C的加入量分别为1%、2%和5%时，乙氧基喹啉的回收率为82.6%～86.2%。为保证充分的抗氧化效果，实验选择维生素C的加入量为2%。

2.2.2 碱的加入与优化比较了加入5 mL不同浓度的碳酸钠溶液(0.47、0.94、1.89 mol/L)和氢氧化钠溶液(0.05、0.1、0.2 mol/L)碱化样品后对提取效率的影响。结果显示，加入不同浓度的碳酸钠溶液和氢氧化钠溶液后，苹果、橙子和葡萄样品中乙氧基喹啉的回收率分别为70.2%～82.5%和76.7%～84.3%，差别较小。而加入碳酸钠溶液和氢氧化钠溶液后样品的pH值分别为8～9和11～12，表明经氢氧化钠调节后的碱性更强。进一步对比发现，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液时的回收率最高(84.3%)，因此选择加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液碱化样品。

2.2.3 提取次数的优化本研究采用加碱后再加入正己烷提取的方式，为保证充分提取，选择苹果、橙子、葡萄3种基质对提取次数进行了优化。实验结果显示，提取次数为2次时即可达到充分提取，3种基质中乙氧基喹啉的回收率分别为80.4%、80.0%和 86.8%，因此选择提取2次。

2.2.4 氮吹浓缩温度的优化样品经正己烷提取后，需将提取溶液浓缩后再用乙腈复溶。由于乙氧基喹啉在室温下为液态，沸点为125 ℃，较高的氮吹温度对回收率影响较为明显。本研究分别用苹果、橙子、葡萄3种基质考察了不同温度下(30、40、50 ℃)氮吹对回收率的影响。结果表明，氮吹温度为40 ℃和50 ℃时，乙氧基喹啉的损失较大，回收率均小于60%；而氮吹温度为30 ℃时，回收率均较好(>80%)，因此选择氮吹温度为30 ℃。

2.3 方法学考察

2.3.1 基质效应为考察基质以及维生素C饱和的乙腈对乙氧基喹啉的影响，在进行定量测定时同时制备了基质标准曲线和维生素C饱和的乙腈配制标准曲线。采用相对响应值法，即通过计算两曲线的斜率之比来考察基质效应。结果显示不存在较强的基质效应，但使用维生素C饱和的乙腈配制标准曲线与乙腈配制相比有一定的响应增强作用，因此采用维生素C饱和的乙腈配制标准曲线进行定量检测。

2.3.2 线性关系量取质量浓度分别为2、5、10、20、50、100 μg/L的系列标准工作溶液，在优化的色谱条件下进行测定，以峰面积(Y)对相应的质量浓度(X，μg/L)绘制标准曲线。结果表明，乙氧基喹啉在2～100 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r)为0.999 99，线性方程为y=0.230 4x+0.001 0。

2.3.3 检出限与定量下限在空白苹果样品中分别添加0.01、0.02、0.05、0.08 mg/kg的标准溶液，按照本方法进行样品前处理和测定。结果表明，乙氧基喹啉的信噪比均大于3，当加标水平不低于0.02 mg/kg时其信噪比均大于10，且回收率均在60%～120%之间。同时，鉴于待测物为可使用的食品添加剂，综合考虑，将本方法的检出限(LOD)定为0.01 mg/kg，定量下限(LOQ)定为0.02 mg/kg。

2.3.4 回收率考察以苹果、梨、葡萄、橙子为代表基质，进行加标回收实验。准确称取5 g(精确至0.01 g)空白样品，添加乙氧基喹啉标准品，分别制成加标水平为0.02、0.04、0.2、1 mg/kg的样品各6份，按本方法进行加标回收实验。由表1可见，各加标水平下的平均回收率为80.4%～108%，相对标准偏差(RSD)为1.4%～8.1%，方法的准确度和精密度均满足残留分析的要求。

表1 乙氧基喹啉在4种基质中的平均回收率和相对标准偏差(RSD)(n=6)Table 1 Average recoveries and RSDs of ethoxyquin in 4 kinds of fruit matrix(n=6)

2.3.5 实验室间协作验证结果为验证本方法的有效性和适用性，通过前述5家检测机构对本方法进行验证。结果显示，乙氧基喹啉在2～500 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.999；方法检出限浓度下的色谱峰信噪比均大于3；各加标水平的平均回收率为67.7%～102%，RSD为0.70%～9.4%，方法准确度和精密度均能满足相关要求。

2.4 实际样品检测

从市场上购买苹果、梨、葡萄、橙子4种水果共30份，应用本方法进行测定，样品中均未检出乙氧基喹啉残留。

3 结 论

本研究建立了测定多种水果中乙氧基喹啉残留量的液相色谱-荧光检测法，通过对仪器分析条件、抗氧化剂、样品碱化以及浓缩温度等因素的优化，使方法的准确度、灵敏度得到提高。方法检出限和定量下限分别达0.01、0.02 mg/kg，平均回收率为80.4%～108%。本方法实用性强、可操作性好、仪器设备简单，适用于多种水果中乙氧基喹啉残留量的测定。