基于质谱裂解机理的深加工羊肉制品中兽药残留非定向筛查技术研究

贾 玮，徐 曦，石 琳，贺 博，樊 成，储晓刚,4

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.农业农村部富硒产品开发与质量控制重点实验室，陕西 安康 725000；3.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048；4.中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

随着养殖业的规模化发展，兽药被添加到饲料中以预防与治疗动物疾病，导致药物残留通过生物食物链富集进而危害人体健康[1]。近年来，深加工肉类制品因具有流通效率及附加值高等优势而备受青睐[2]。我国虽是羊肉生产大国，但我国羊肉类产品的标准化程度较低，检疫制度尚不健全，且受技术性壁垒影响，亟待发展深加工羊肉制品中兽药的高通量测定方法[3]。

目前，食品中兽药残留分析主要以靶向筛查为主，非定向筛查尚未建立系统的鉴定体系[4-5]。由于兽药种类及代谢物繁多，类别间差异大，应用传统色谱-质谱技术进行靶向分析通常依赖离子通道信息在目标物选定范围内识别分析物，易造成假阳性结果，且对复杂基质缺乏抗干扰能力。高分辨质谱具有高灵敏度、高选择性及良好的重现性，可通过兽药分子离子精确质量数和高分辨碎片离子对非定向目标物进行筛查[4]。而基于高分辨质谱的非定向分析依据目标物分布的质荷比范围，可动态调整每个窗口的宽度，对分析物信息均匀地采集，能够实现一次运行中获得大量的目标物，并精准确认详细的结构信息，以提高方法的选择性[6]。

本文运用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(UHPLC-Q-Orbitrap MS)在全扫描数据非依赖筛查(Full MS/dd-MS2)模式下建立34种兽药的标准数据库，对7类(磺胺类、四环素类、苯并咪唑类、大环内酯类、喹诺酮类、β-内酰胺类、氯霉素类)兽药的特征片段及断裂规律进行研究。采用全扫描数据非依赖采集(Full MS/vDIA)模式结合已知的特征碎裂片段建立深加工羊肉制品中兽药残留的非定向筛查方法，以完善深加工肉类制品的质量安全检测方法体系。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

UltiMate 3000-Q-Exactive超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱；AL204-IC型分析天平；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；Vortex Genie2T型旋涡混合器(美国Scientific Industries公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TGL-16C型高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯)购自德国Merck公司；34种标准品(纯度均大于99%)购自德国Dr.Ehrenstofer公司；无水硫酸镁、无水硫酸钠、无水乙酸钠、氯化钠(美国Sigma公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18(美国Welch公司)；预包装羊肉卷等系列深加工羊肉制品购自西安市本地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制分别称取适量各标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液，于-20 ℃冷冻保存；移取适量标准储备液，用甲醇稀释并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制相应质量浓度的混合标准工作溶液，于-20 ℃保存；用空白样品提取液逐级稀释混合标准工作溶液，制备基质匹配标准溶液。

1.2.2 样品前处理提取：称取绞碎均匀的羊肉样品2 g(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中，分别加0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(柠檬酸缓冲液)、1%甲酸-乙腈溶液各5 mL,振荡提取2 min，5 000 r/min离心5 min，收集上清液；残渣中再分别加入5 mL提取液，于20 ℃超声水浴中20 min后，离心5 min。

净化：合并两次提取上清液，加入2 g无水硫酸镁、3 g无水乙酸钠和3 g氯化钠涡旋1 min，7 000 r/min离心5 min；将上清液转移至另一试管中，加入470 mg C18、430 mg PSA及200 mg无水硫酸钠，涡旋混匀后以8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜后，上机测定。

1.2.3 色谱-质谱条件色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS3-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；柱温：35 ℃；流动相：A为0.1%(体积分数，下同)甲酸-4 mmol/L甲酸铵溶液，B为0.1%甲酸-4 mmol/L甲酸铵-甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。梯度洗脱程序：0～1 min，100% A；1～7 min，100%～0% A；7～12 min，0% A；12～13 min，0%～100% A；13～15 min，100% A。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；全扫描模式与数据非依赖采集模式；毛细管电压：3 500 V；碰撞气：N2；干燥气流量：13 L/min；离子源温度：350 ℃；鞘气流量：12 L/min；辅助气流量：3 L/min；采集范围：m/z100～1 500；全扫描模式质谱分辨率：60 000 FWHM，二级质谱分辨率：17 500 FWHM。

2 结果与讨论

2.1 数据库的建立

按照“1.2.1”，将混合标准工作溶液稀释配制成质量浓度为200 μg/mL的标准工作溶液，在Full MS/dd-MS2模式下建立标准数据库。采集的信息主要包括分子离子质荷比(理论值)、二级碎裂片段的质荷比与保留时间。本实验分子离子的离子化形式主要为[M+H]+，为保证数据的准确性与重现性，每种化合物平均进样6次，各化合物准分子离子的精确质量数测定的相对偏差均小于5×10-6。以密度泛函理论为基础，结合Mass Frontier软件，基于电离模式与结构式推测碎片的断裂途径，筛选出响应值高的特征碎裂片段，依据元素构成阈值推算质谱裂解反应生成碎裂片段的理论值，并建立目标物的标准数据库[7]。

应用mzVault软件对标准数据库进行数据管理，用于化合物名称、分子式、质荷比等的谱图检索。34种化合物的标准数据库信息如表1所示。

2.2 片段碎裂特征及其在兽药残留筛查中的应用

2.2.1 断裂机理研究实验对7类兽药的二级质谱裂解行为进行研究，获得了34种化合物的片段裂解途径，以喹诺酮类的恩诺沙星为例，其裂解途径如图1所示。恩诺沙星的分子离子质荷比理论值为m/z360.171 80，该化合物在电喷雾质谱中的裂解过程主要为电子迁移反应、电荷中心诱导的键断裂(i断裂)和远端重排反应(rHR)。在ESI+状态下，正电荷中心位于喹诺酮萘啶环结构的取代基原子上，加氢离子峰m/z360.17 180[M+H]+经i断裂，在正电荷的吸引下，使连接在N原子上的单键断裂，m/z360.171 80中性丢失1分子C8H5N，形成碎片离子m/z245.108 47[M+H-C8H5N]+；m/z72.080 78碎片来源于哌嗪环另一种重排方式，m/z360.171 80中性丢失1分子C18H10O3N形成碎片离子[M+H-C18H10O3N]+；m/z360.171 80与m/z342.162 32相比减少了18 Da，是由准分子离子进行γ位氢原子重排反应异构化后中性丢失1分子H2O，得到m/z342.161 23[M+H-H2O]+脱水碎片离子。

图1 恩诺沙星的断裂机理Fig.1 Fragmentation mechanism of enrofloxacin

CategoriesCompoundMolecular formulaRetention time/minPrecursor(m/z)Fragment 1(m/z)Fragment 2(m/z)β-LactamsAmoxicillin(阿莫西林)C16H25N3O8S3.87366.111 63193.061 05160.042 97(β-内酰胺类)Cefapirinsdium(头孢匹林钠)C17H17N3NaO6S24.16424.063 05364.041 99320.050 90Ampicillin(氨苄青霉素)C16H19N3O4S3H2O4.97350.116 67333.091 19305.095 40Penicillin G(青霉素 G)C16H18N2O4S6.26335.105 65317.095 49220.042 863,5-Dinitro-o-toluamide(3,5-二硝基邻甲酰胺)C8H7N3O55.16224.031 43181.025 5641.998 54ChloramphenicolsThiamphenicol(甲砜霉素)C12H15Cl2NO5S4.53353.998 17335.987 09185.027 69(氯霉素类)Florfenicol(氟苯尼考)C12H14Cl2FNO4S5.03355.993 84272.040 62185.027 69Tetracyclines(四环素类)Oxytetracycline hydrochloride(盐酸土霉素)C22H25ClN2O95.78461.155 61337.060 68226.071 27SulfonamidesSulfadiazine(磺胺嘧啶)C10H10N4O2S4.08251.059 75158.004 64156.011 47(磺胺类)Sulfathiazole(磺胺噻唑)C9H9N3O2S24.25256.020 97156.011 52140.016 37Sulfadimethoxine(磺胺二甲氧哒嗪)C12H14N4O4S5.65311.080 87279.054 64218.024 19Sulfamethazine(磺胺二甲嘧啶)C12H14N4O2S4.70279.091 09186.033 05156.011 51Sulfamethoxypyridazine(磺胺甲氧哒嗪)C11H12N4O3S4.80281.070 28263.035 91156.011 44QuinolonesMarbofloxacin(麻保沙星)C17H19FN4O44.88363.146 31344.948 09319.912 90(喹诺酮类)Enoxacin(依诺沙星)C15H17FN4O35.01321.135 89303.125 40293.105 19Norfloxacin(诺氟沙星)C16H18FN3O35.01320.140 59302.130 10282.122 77Danofloxacin(达氟沙星)C19H20FN3O35.19358.156 10342.161 71340.145 05Ciprofloxacin(环丙沙星)C17H18FN3O35.20332.140 47314.129 79312.133 91Enrofloxacin(恩诺沙星)C19H22FN3O35.23360.171 80342.160 86316.181 55Lomefloxacin(洛美沙星)C17H19F2N3O35.25352.146 85334.136 72324.116 21Tilmicosin(替米考星)C46H80N2O136.29879.573 67696.467 22678.458 98BenzimidazolesThiabendazole(噻苯咪唑)C10H7N3S5.17202.043 92187.032 45175.032 45(苯并咪唑类)Mebendazole(甲苯咪唑)C16H13N3O36.70296.103 06264.076 67236.081 04Oxfendazole(奥芬达唑)C15H13N3O3S6.10316.075 13284.048 77175.037 75Thiabendazole(噻苯咪唑)C10H7N3S6.30202.043 92187.032 45175.032 45Oxibendazole(丙氧苯咪唑)C12H15N3O36.35250.118 62218.092 39208.071 64MacrolidesTylosin(泰乐菌素)C46H77NO176.46916.526 43174.101 84772.501 13(大环内酯类)9-Amino-9-deoxoerythromycin(红霉胺)C37H70N2O125.96735.504 37158.125 47577.402 43Oleandomycin(竹桃霉素)C41H67NO146.51688.427 31544.348 82158.117 78Erythromycin A(红霉素A)C37H67NO136.94734.468 52576.230 32716.210 12Tylosin tartrate(酒石酸泰乐菌素)C50H83NO236.70916.526 86772.501 13174.101 84Erythromycin(红霉素)C37H67NO136.81734.468 93576.374 94558.363 65Roxithromycin(罗红霉素)C41H76N2O156.94837.531 85158.102 12679.413 52Lincomycin(林可霉素)C18H37ClN2O7S7.37371.219 36386.186 99346.131 88

2.2.2 片段断裂特征离子在不同能量下与高纯度N2碰撞，片段断裂具有规律性。其核心是电子转移规律，主要类型有H转移重排(游离基诱导的重排和电荷诱导的重排)、电荷中心诱导断裂、简单键断裂(α、σ、β)[8]。

通过对喹诺酮类药物的裂解机理进行研究，发现喹诺酮类药物具有稳定的母核喹诺酮萘啶环结构，离子断裂方式主要为中性丢失—H2O、—CO2、—HF、—CO、—CH2CH2，脱羧后均发生哌嗪环结构的重排反应。重排方式有两种，碎片离子主要为脱羧产物与哌嗪环结构重排产物。以恩诺沙星为例，其分子式为C19H22FN3O3，研究表明，恩诺沙星、麻保沙星、洛美沙星的断裂特征一致，均生成C4H10N+(m/z72.080 78)碎片离子。对大环内酯中红霉素类药物进行研究，以泰乐菌素为例，其分子式为C46H77NO17，而实验发现红霉胺、红霉素A、罗红霉素和泰乐菌素等药物均有C5H7O+(m/z83.049 14)碎片离子。因此，药物效能与分子离子裂解特征一致，特征碎片离子可用于该类化合物的筛查。

表2列出了7类兽药的特征碎裂片段。其中，①磺胺类兽药的活性基团为对氨基苯磺酰胺结构，该结构与氨苯甲酸结构相似，因而可与氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，抑制二氢叶酸的合成，进而影响细菌的嘧啶和嘌呤核苷酸的形成，阻碍细菌生长繁殖[9-11]。对氨基苯磺酰胺结构的质谱碎片为C6H6NO2S+(m/z156.011 38)。②四环素类兽药的功能基团为并四苯基本骨架结构，该结构与细菌的核蛋白体的30S亚单位结合，阻碍酰胺基转运RNA到达A位，抑制核蛋白体与核糖结合[12]。并四苯基本骨架结构的质谱碎片为C19H13O6+(m/z337.070 66)。③苯丙咪唑类兽药的功能基团为苯丙咪唑结构，此结构通过选择性阻碍真菌细胞色素依赖性的去甲基酶活性，使甲基固醇蓄积，抑制细胞膜麦角固醇合成，从而导致细胞膜的通透性改变，真菌细胞内物质流失而死亡[13]。苯丙咪唑结构的质谱碎片为C4H8N+(m/z70.065 13)。④大环内酯类兽药为糖衍生物与大环内酯基团以糖苷键相连而成的抗生素，大环内酯结构通过与细菌核糖体50S亚基23SrRNA结合，抑制信使RNA位移与转肽作用，从而阻碍相应的蛋白质合成[14]。大环内酯结构的质谱碎片为C5H7O+(m/z83.049 14)。⑤喹诺酮类兽药的功能基团为氮(杂)双并环结构，该结构通过抑制脱氧核糖核苷酸回旋酶活性，使双股脱氧核糖核苷酸无法扭曲成为超螺旋结构，阻止细菌细胞分裂[15]。氮(杂)双并环结构的质谱碎片为C4H10N+(m/z72.080 78)[15]。⑥β-内酰胺类兽药的活性结构为β-内酰胺环，此结构可与青霉素结合蛋白相结合，阻碍细菌的细胞壁粘肽合成酶活性，造成细胞壁缺损，使细菌最终膨胀裂解。β-内酰胺环结构的质谱碎片为C5H10NO2+(m/z116.070 60)[16]。⑦氯霉素类兽药的功能基团为二氯乙酰胺结构，此结构可与细菌核糖核蛋白体的50S亚基结合，阻碍转肽酰酶的作用，抑制50S亚基与胺基酰转运RNA终端结合，从而阻碍形成新的肽链，导致蛋白质无法合成[17-18]。二氯乙酰胺结构的质谱碎片为C4H4Cl2NO-(m/z151.967 54)。

表2 34种兽药的特征碎裂片段Table 2 Characteristic fragmentations of 34 veterinary drugs

2.2.3 特征碎裂片段在兽药筛查中的应用将特征碎裂片段结合标准数据库信息应用于未知兽药残留筛查。第一步，运用Full MS/vDIA扫描模式，采用表2中兽药特征碎裂片段的精确质量数提取色谱峰；第二步，分析捕集的呈高斯分布的色谱峰，并比对兽药的标准数据库信息，判断该物质的归属类别；第三步，通过分析片段的质谱信息(m/z、同位素峰度比、片段峰度比)及断裂途径，推断该物质的元素组成；第四步，利用标准物质的色谱、质谱信息进行确证和定量。

图2 双氟沙星的高分辨质谱图Fig.2 High resolution mass spectrum of difloxacin

例如，在筛查深加工羊肉制品中的兽药残留时，Full MS/vDIA扫描模式下采用兽药的特征断裂片段从总离子流图中提取呈高斯分布的质谱信息，如图2所示，该化合物的碎裂片段为氮(杂)双并环结构，初步判定该物质为喹诺酮类药物，分子式为CaHbNcOdFe。结合密度泛函理论对该片段的碎裂途径进行分析，将峰度较高的碎裂途径与质谱数据库标准信息进行比对，发现该化合物的碎裂途径(图3)与恩诺沙星相似，通过匹配标准物质信息，最终确证其为双氟沙星，分子式为C21H19N3O3F2，定量结果为1.5 μg/kg。

图3 双氟沙星的断裂途径Fig.3 Proposed fragmentation of difloxacin

2.3 筛查方法建立

筛查方法主要有两步：筛选与确证，判定的基础为7类兽药的标准数据库与其相应的化学标准物质。本实验主要按照以下步骤筛选：按照“1.2”方法对样品进行前处理与质谱检测，扫描方式为Full MS/vDIA；加载谱库与特征碎裂片段；加载筛查方法；数据处理。当应用设定的保留时间与质荷比质量偏差提取窗口提取到响应强度≥8.3×104的色谱峰时，初步判断为阳性样品，通过同位素离子峰信息与二级碎裂片段丰度比进行确证；若未提取到色谱峰，初步判断为阴性样品，进一步提取与分析特征断裂片段，对未知目标物质进行筛查分析，进而得出结论。采用Exact Finder软件分析全扫描及二级碎裂片段谱图，提取目标物信息。

2.4 基质效应

通过在空白羊肉基质提取液中添加混合标准溶液，以基质效应(ME)=(1-基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)×100%来评价目标物的基质效应[19-20]。当ME在±20%范围内，表明基质效应较弱；当ME的绝对值大于20%或小于50%时，表明存在中等强度的基质效应；当ME的绝对值大于50%且小于100%时，表明基质效应较强。结果显示，34种化合物均存在一定程度的基质效应，在建立校准曲线时，采用基质匹配标准工作溶液进行校正补偿，以减小基质效应对检测结果的影响。

2.5 方法学考察

依据欧盟SANCO/12571/2015[21]与2002/657/EC[22]考察回收率、精密度、检出限、定量下限与相对标准偏差。本实验采用CCα与CCβ分别表示方法检出限与定量下限。CCα的测定采用校准曲线法，使用羊肉制品空白样品，按照等距离梯度添加混合标准物质，根据添加标准物质的浓度与峰面积绘图，CCα则等于能观察到响应时纵坐标轴上的浓度值与对应重现性标准偏差的2.33倍之和。CCβ为CCα与CCα取值时重现性标准偏差的1.64倍之和。由表3可见，34种兽药在对应浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.99，检出限和定量下限分别为0.04～4.76 μg/kg和0.07～8.24 μg/kg。在空白样品中分别加入1倍、2倍和4倍CCβ 3个浓度水平的兽药系列混合标准溶液进行回收率实验，每个浓度水平重复6次。34种兽药的平均回收率为79.4%～110%，相对标准偏差(RSD)为0.30%～7.5%，表明此方法具有较好的准确度和精密度。

表3 34种兽药的线性关系、CCα、CCβ、回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Linear relations，CCα，CCβ,recoveries and relative standard deviations of 34 standards(n=6)

2.6 实际样品测定

应用建立的方法筛查市售36份深加工羊肉制品中的兽药残留，检出2份阳性样品，其提取离子流色谱图见图4。其中1份检出磺胺二甲嘧啶(图4A)，含量为2.2 μg/kg；另1份检出标准数据库外的化合物双氟沙星(图4B)，含量为1.5 μg/kg。结果表明，本方法可满足兽药残留的日常监测需求。

3 结 论

本研究通过UHPLC-Q-Orbitrap MS，采用Full MS/dd-MS2与Full MS/vDIA两种模式，总结了7类兽药的结构碎片与片段断裂特征，建立了快速筛查深加工羊肉制品中未知兽药残留的非定向测定方法。方法学验证表明，34种兽药的检出限和定量下限分别为0.04～4.76 μg/kg和0.07～8.24 μg/kg，平均回收率为79.4%～110%，相对标准偏差为0.30%～7.5%。本方法可满足食品检测机构应对复杂基质中未知兽药残留快速筛查和风险评估的需求。