基于核酸适配体功能化荧光氧化石墨烯的免标记“Turn-off”型Hg2+传感器研究

杨 梅，张 何，雷湘玲，傅 昕，王 青，周宁涛

(湖南工程学院 化学化工学院，湖南省环境催化与废弃物再生化重点实验室，湖南 湘潭 411104)

重金属污染指由重金属或其化合物造成的环境污染，主要由矿产开采、污水排放和使用重金属超标制品等人为因素导致。汞(Hg)是环境中毒性最强的重金属元素之一，具有生物富集性和生物非降解性，可导致汞中毒并引发尿血、尿毒症等疾病[1-3]。二价汞离子是汞在水体中的主要存在形式[4-5]，目前传统的汞离子检测方法主要有荧光光谱法[6]、电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)[7]、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)[8]、冷蒸气原子荧光光谱法[9]、荧光猝灭法[10]等，这些方法具有较好的特异性、准确性及灵敏度，但存在依赖精密仪器，操作过程复杂，成本较高等缺点，难以实现现场快速检测。因此建立一种灵敏度高、成本低、操作简单的汞离子传感技术具有重要的现实意义。

石墨烯(Graphene)在2004 年由英国科学家Geim 等首次成功制备，是一种由 sp2杂化的单层碳原子紧密堆积组成的二维蜂窝状碳纳米材料。石墨烯及其衍生物具有优良的光学、力学、热学及化学性能，在荧光特性方面，石墨烯及其衍生物以环境友好、光致发光能力强、机械强度高、水溶性好、表面修饰容易等优点，成为一种应用广泛的新型荧光物质，在生物传感器、环境检测、疾病检测、细胞成像等领域发挥着越来越重要的作用[11-13]。研究发现，胸腺嘧啶与汞离子之间能够通过N—Hg键形成T-Hg2+-T结构，并且该结构中的N—Hg键比Watson-Crick氢键更稳定[14]，因此构建富T核酸适配体探针可以实现汞离子的高选择性识别。目前基于该结构已发展了许多汞离子检测新技术，如荧光光度法[15]、电化学方法[16]、表面等离子体共振[17]、表面增强拉曼散射[18]和比色传感器[19-20]等。

本研究以纳米金(AuNPs)复合的氧化石墨烯为荧光材料，以选择性结合Hg2+离子的巯基化单链富T核酸适配体(Aptamer)为分子识别探针，并基于该探针与Hg2+结合后能将氧化石墨烯的荧光猝灭的特性，构建了一种简单、低成本、免标记、快速的“turn-off”型石墨烯基Hg2+检测技术，可用于自来水、湖水、河水等环境水体中汞离子的现场检测。因为该复合材料比石墨烯、金纳米颗粒单独存在时表面积更大，使得aptamer在AuNPs上的修饰更加容易，同时该材料还具有较大的比表面积，可显著提高电子转移速率[21]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-1800 型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);Milli-Q Reference 超纯水仪(德国默克密理博公司);pH-2602 酸度计(上海天达仪器有限公司)；手提式压力蒸汽灭菌器(浙江新丰医疗器械有限公司);真空干燥箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；高速离心机(艾本德生命科学公司)；荧光分光光度计(美国PE公司)；超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

石墨粉、硝酸钠、高锰酸钾、双氧水、柠檬酸三钠、氯金酸、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇、二氯化汞及其它金属离子盐均购自上海生工生物工程股份有限公司。所用试剂均为分析纯，使用时未经进一步纯化，实验用水为去离子水。aptamer 探针由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列为5'-SH-(CH)6-TTCTTTCT TCGCGTTGTTTGTT- 3'。

1.2 实验过程

1.2.1 Hummers法制备氧化石墨烯(GO)[22-24]搭建实验装置，以搅拌器为主体，放上小水盆，利用支架(铁架台)固定250 mL三口烧瓶，调整搅拌头与烧瓶底部的位置，以接触而不压住为宜，可开启搅拌器检验效果。

低温处理：向水盆中加入适量冰块与水(覆盖烧瓶1/2体积为宜)，烧瓶中加入23 mL浓硫酸并安放好温度计，在冰水浴下冷却至5 ℃以下，依次加入1.0 g石墨粉、0.25 g NaNO3(注意尽量不要沾在玻璃容器壁上)，在冰水浴5 ℃以下，充分搅拌反应 30 min。

低温反应：将准备好的3.0 g KMnO4缓慢分批加入，持续至少0.5 h，并控温10 ℃以下反应2 h；中温反应：缓慢升温至35～40 ℃(可采用水浴法)并恒温1 h，中温、低温时间只能多不能少，此时溶液呈粘稠墨绿色；高温反应：缓慢小心加入46 mL蒸馏水，使硫酸遇水放出大量的热，将体系温度稳定在98 ℃左右，若温度计升温较快，上升到85 ℃左右时暂停加水，等稳定后继续添加，防止温度过高，解离后的石墨片层在高温下发生聚合反应，出现黑色颗粒聚集。若达不到预期温度，用提前备好的沸水水浴或者电热套等直接加热，恒温15 min(95 ℃左右亦可，溶液高温处理后呈现亮黄色为佳，继续加热10～15 min，整个高温阶段不宜超过30 min)；冷却10 min，达到室温(可以用冰水冷却)，然后加140 mL蒸馏水稀释，以3 mL 30% H2O2洗至溶液无气泡产生，混合溶液呈亮黄色。

抽滤：用5% HCl 50 mL多次洗涤，再用适量蒸馏水洗涤至黑色，然后进行反复加水离心处理，转速4 000 r/min，待pH值接近中性时停止离心，并收集氧化石墨于烧杯中，取出所得产物，于60 ℃下真空干燥过夜，即得到干燥的氧化石墨烯。

1.2.2 石墨烯-金纳米颗粒复合材料的制备[25]称量30 mg的自制GO，加入30 mL去离子水，使用超声波细胞破碎仪超声处理(80 W)2 h，得到质量浓度为1 mg/mL的GO悬浮液。在上述悬浮液中加入0.03 g的柠檬酸三钠，搅拌并加热至70～80 ℃，反应10 min；30 min内分3～5次间隔加入1%的氯金酸共5 mL，此时溶液呈现深紫色，继续反应5～10 min即可停止反应。12 000 r/min离心15 min，离心洗涤3次后悬浮于去离子水中，得到氧化石墨烯-金纳米颗粒复合材料(GO@AuNPs)。

1.2.3 巯基aptamer功能化量取30 mL石墨烯-金纳米颗粒复合材料悬浮液(1 mg/mL)，超声处理3 h(400 W，设定超声2 s间隔3 s)后取1 mL加入100 μL 1 mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)和100 μL 10 μmol/L的aptamer，再用去离子水稀释至5 mL，常温孵育24 h；将上述反应溶液离心(12 000 r/min，10 min)并用10 mmol/L PBS进行多次洗涤以去除游离的DNA，最后加入5 mL 10 mmol/L PBS，获得aptamer-GO@AuNPs悬浮液。

1.2.4 Hg2+的检测将0.5 mL待测样品(含不同浓度Hg2+的水溶液)和0.5 mL aptamer-GO@AuNPs悬浮液混合均匀后常温下反应10 min，分别测定其荧光光谱，选择615 nm处的荧光值作为测量值，计算荧光猝灭效率(IF0-IF)/IF0，其中IF为样品荧光测量值，IF0为Hg2+浓度为0时的荧光值。将100 nmol/L的Ag+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Co2+、Ca2+分别加入到上述的aptamer-GO@AuNPs悬浮液中，考察该检测系统的特异性。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

通过Hummers法制备出氧化石墨烯(GO)，随后以柠檬酸三钠为还原剂，在无稳定剂、温和的液相反应条件下，于氧化石墨烯表面原位还原氯金酸形成金纳米颗粒，制备出氧化石墨烯负载金纳米颗粒复合材料。氧化石墨烯负载的金纳米颗粒可以和aptamer上修饰的巯基形成强共价键(Au—S)并稳定结合形成aptamer-GO@AuNPs。汞离子存在时，由于7个T-Hg2+-T结构的配位作用，aptamer折叠形成刚性的发夹状双链DNA结构，并使Hg2+靠近石墨烯表面(少于1 nmol/L)，电子可沿着双链DNA通道从石墨烯转移到汞离子，从而猝灭氧化石墨烯的荧光[26]。纳米金的引入使得aptamer探针的修饰变得容易，同时经过纳米金修饰的氧化石墨烯比表面积更大，有利于检测信号的进一步放大。

图1 基于氧化石墨烯荧光猝灭的免标记Hg2+检测原理示意图Fig.1 Principle of the label-free detection of Hg2+ based on quenching of the fluorescence emission of graphene oxide

2.2 复合材料的表征

图2A为GO薄片的AFM图像，制备的GO薄片尺寸较为均一，长度为600 nm，宽度为400 nm，高度为20 nm(图2B)。图2C是氧化石墨烯负载金纳米颗粒的SEM图像，从图中可看出大量的金纳米颗粒均匀地分布在氧化石墨烯薄片上，粒径在20 nm左右，而且单层附着的金纳米颗粒团聚少，粒径较为均匀，说明两者复合效果好。图2D为氧化石墨烯与不同含量(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)的氯金酸溶液反应后制备的GO@AuNPs的紫外可见吸收光谱图,从图可看出复合材料在540 nm 左右有较强的吸收峰，这与纳米金溶液的紫外吸收特征峰基本相符。随着氯金酸含量的升高，制备的GO@AuNPs复合材料在540 nm左右的吸收峰也相应升高，说明在石墨烯表面生长了更多的纳米金颗粒。

图3 GO及其复合材料的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of GO and its composites

考察了GO、GO@AuNPs、aptamer-GO@AuNPs、aptamer-GO@AuNPs+Hg2+的荧光光谱变化情况(图3)。从图3可以看出，GO具有明显的近红外荧光，半峰宽较大(接近200 nm)；而在制备GO@AuNPs的过程中，柠檬酸三钠的加入使得GO存在一定程度的还原，导致GO部分发光中心被去除(700～850 nm)，一些发光中心被保留(600～700 nm)，并出现了强的新发光中心(610 nm)，表现为GO@AuNPs的荧光峰半高宽变小(接近90 nm)。GO@AuNPs在修饰上aptamer探针后(aptamer-GO@AuNPs)，其荧光光谱的峰位、半峰宽无明显变化，但荧光强度略有降低，可能是在修饰过程中GO@AuNPs有少量损失，或者aptamer探针修饰在复合材料的表面，对发光中心的光致发光性能产生了一定的影响。加入Hg2+后，aptamer-GO@AuNPs复合材料的荧光强度迅速下降，说明Hg2+导致的发夹状双链DNA结构能有效将电子从石墨烯传递到汞离子，从而猝灭了氧化石墨烯的荧光。

2.3 实验条件的优化

由于在GO@AuNPs复合材料的制备中，当金纳米颗粒在石墨烯表面的覆盖率过高时，将导致石墨烯的荧光被直接猝灭，因此考察了不同含量(0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)氯金酸形成的GO@AuNPs复合材料(1 mg/mL)在600 nm处的荧光发射强度。发现随着金纳米颗粒的负载，氧化石墨烯的荧光逐渐减弱，在氯金酸含量为0.1%～1.0%时，其荧光强度降低较慢，随后荧光值快速下降(图4A)，因此在后续实验中采用1.0%氯金酸制备GO@AuNPs复合材料。

考察了aptamer-GO@AuNPs与Hg2+的孵育时间对荧光猝灭效率的影响，如图4B所示，当孵育时间为10 min时，其荧光猝灭效率达90%，因此后续实验采用10 min作为aptamer-GO@AuNPs复合材料与Hg2+的反应时间。

2.4 Hg2+的定量检测

在aptamer-GO@AuNPs复合材料的悬浮液中分别加入不同浓度(0、0.1、0.5、1、10、20、50、100、500 nmol/L)的Hg2+，考察了Hg2+浓度对反应体系荧光强度的影响。由图5A可知，随着Hg2+浓度的增大，反应体系的荧光强度不断减弱，当Hg2+浓度超过100 nmol/L时，荧光值基本保持稳定(图5B)。Hg2+浓度(c，nmol/L)在0.5～80 nmol/L之间与荧光猝灭效率(IF0-IF)/IF0(y)呈现良好的线性关系，回归方程为y=0.214+0.007c，线性相关系数r2为0.996。以空白的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到本方法的检出限为0.3 nmol/ L，远低于中国《生活饮用水卫生标准》规定的饮用水中无机Hg2+的最高允许水平(<5 nmol/L)。结果表明，该方法对Hg2+的定量分析具有较高的灵敏度和良好的线性度。

图6 Hg2+传感器的选择性分析Fig.6 Selectivity of the proposed sensor towards detection of Hg2+

2.5 Hg2+检测的选择性

考察了8种常见的金属离子(Ag+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Co2+、Ca2+)对体系识别Hg2+的影响。结果显示，在其它金属离子存在时，检测体系的荧光强度无明显变化(图6)，说明只有富T碱基的aptamer与Hg2+特异性结合后才能折叠形成刚性的发夹状双链DNA结构，并使Hg2+靠近石墨烯表面猝灭其荧光;其他金属离子不能构建GO的电子传递通道。综上所述，由于aptamer对Hg2+的较高特异性，使得该传感器具有优良的选择性。

2.6 实际样品分析

为考察本方法用于环境水体样品中Hg2+检测的可行性，分别采集自来水、湘江水以及湖水样本，进行3个水平(1.0、10.0、50.0 nmol/L)的加标回收实验，样品使用前过滤去除悬浮颗粒及杂质。如表1所示，3种不同来源水体样品的加标回收率为96.0%～105%，相对标准偏差(RSD)为1.4%～3.2%。结果表明，本方法具有良好的准确度和灵敏度，能够满足环境水体中 Hg2+污染检测的要求。

表1 环境水体样品的加标回收实验结果(n=5)Table 1 Results of spiked recoveries of environmental water samples(n=5)

3 结 论

基于Hg2+能够猝灭aptamer功能化氧化石墨烯-金纳米颗粒复合材料荧光的特性，发展了一种免标记、快速的Hg2+传感技术。该技术操作简单，耗时仅10 min，具有高的灵敏度和选择性，抗干扰能力强，稳定性好，在环境水体样本的检测中表现出良好适应性，为环境检测和临床医学诊断提供了一种实用、有效且廉价的检测方法。