CdSe/CdS量子点荧光探针测定蔬菜中灭蝇胺的残留量

谭华东，赵淑巧，武春媛*

(1.中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；2.农业农村部儋州农业环境科学观测实验站，海南 儋州 571737；3.海南省热带生态循环农业重点实验室，海南 海口 571101)

灭蝇胺(Cyromazine，Cyr)，又名环丙氨嗪，化学名为N-环丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一种三嗪类昆虫生长调节剂，可诱导昆虫形态发生畸变，主要用于叶菜类、菜豆类和瓜果类的美洲斑潜蝇、潜叶蝇防治。Cyr不易发生水解(pH为5～9)，可被光降解，但主要产物三聚氰胺被世界卫生组织(WHO)列为2B类致癌物。在动植物体内，Cyr可经脱烷基化转化为三聚氰胺[1-2]。动物毒理实验表明，Cyr及代谢产物的毒性具有明显的剂量-效应关系，会损害动物健康，引起体重降低、肝肿大、血红蛋白及血细胞数减少等问题，甚至导致动物胎儿骨骼发育迟缓，存活率下降[3-4]。在果蔬种植中，Cyr的不规范、过量使用易使其残留于果蔬中，进而危及人体健康。因此，许多国家、国际组织制定了Cyr在农产品中的最大残留限量值(MRL)，其中我国规定Cyr在菜豆、黄瓜中的MRL分别为0.5、1.0 mg/kg，欧盟、美国和日本规定其在果蔬中的MRL为0.05～0.5 mg/kg[5-8]。

目前，Cyr的检测方法有气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[9-11]。但GC-MS法需进行衍生化，检测过程较繁琐；HPLC、LC-MS/MS法易受基质干扰，前处理操作要求高、费时，需使用大型仪器，且溶剂用量大，易污染环境。因此，建立一种快速简便、灵敏度高、选择性好的Cyr检测方法具有重要的现实意义。

荧光量子点(QDs)因光学性质优异、检测灵敏、简便，而在环境检测领域得到了广泛应用[12-15]。本研究基于Cyr在弱酸性条件下使CdSe/CdS量子点(CdSe/CdS QDs)发生荧光增强的特性[12,16-17]，以巯基乙酸(TGA)为稳定剂制备CdSe/CdS QDs，以此建立了快速、灵敏检测蔬菜中Cyr的新方法。该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，实际检测应用中结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-97 Pro荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司)；JEM 1400EX透射电子显微镜(日本日立仪器公司)；UV-2600/Shimadzu UV-Vis分光光度计(日本岛津仪器公司)；FiveEasy plus pH计(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；Keezo KMS-181E加热恒温磁力搅拌器(精凿科技(上海)有限公司)；JJ-2B组织捣碎匀浆机(上海诺顶仪器设备有限公司)；三口烧瓶回流装置(四川蜀玻(集团)有限责任公司)。

甲醇(CH3OH)、醋酸(CH3COOH，HAc)、醋酸钠(CH3COONa，NaAc)、亚硫酸钠(Na2SO3)、硒粉(Se)、醋酸镉(Cd(CH3COO)2·2H2O)、硫化钠(Na2S·9H2O)、氢氧化钠(NaOH)、巯基乙酸(C2H4O2S，TGA，>91%)购于阿拉丁试剂公司。所用试剂为分析纯及以上纯度，均未经纯化直接使用；实验用水为去离子水；所有实验均在室温下完成。采用pH 5.6的HAc-NaAc缓冲溶液配制QDs溶液及Cyr标准溶液。

1.2 CdSe/CdS QDs的合成

CdSe/CdS QDs的合成基于文献[18]所述方法并进行调整。首先，向20 mL 1.2 mol/L Na2SO3水溶液中加入0.015 mol Se粉，磁力搅拌作用下，在水浴锅中将溶液缓慢加热至75 ℃，充分搅拌至呈黄色、透明Na2SeSO3溶液；然后，将1 mL TGA加入200 mL含有0.022 5 mol Cd2+的Cd(CH3COO)2水溶液中，通过NaOH调节溶液的pH值至10～11，在N2保护下迅速加入上述Na2SeSO3溶液。将溶液缓慢加热至100 ℃，并在N2保护下回流6 h以上，随后自然冷却至室温，停止N2保护，得红色溶胶。

搅拌该红色溶胶，并缓慢加热至40～50 ℃。同时，缓慢、交替地分5次加入0.05 mol/mL Na2S溶液和0.02 mol/mL Cd(CH3COO)2溶液(摩尔比CdS∶CdSe=4∶1)，在N2保护下回流6 h以上；再以7 500 r/min离心5 min，将沉淀分离后，即得橙红色CdSe/CdS QDs。

1.3 样品处理

采用组织搅碎机将新鲜蔬菜样品搅碎，充分混匀，于-19 ℃冰柜中冷冻保存备用。准确称取25 g(精确至0.01 g)样品，置于250 mL锥形瓶中，加入50 mL CH3OH，超声10 min后用布氏漏斗过滤，用CH3OH洗涤烧杯和布氏漏斗，同时采用30 mL CH3OH提取滤纸，合并所有提取液至平底烧瓶中，减压浓缩至50 mL后，以HAc-NaAc缓冲溶液调至pH 5.6左右，转入100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，于-4 ℃冷藏备用。

1.4 Cyr的检测条件

取5.0 μL 0.1 mol/L CdSe/CdS QDs溶液置于10 mL比色管中，加入1 mL不同浓度的蔬菜基质匹配标准溶液，以HAc-NaAc缓冲溶液定容，制得浓度为5.0～120 nmol/L的蔬菜基质匹配标准工作溶液。对于蔬菜样品，测定时加入1 mL “1.3”的样品溶液于10 mL 0.5 mmol/L CdSe/CdS QDs溶液中。在室温条件下混匀反应8.0 min，以优化的波长测定体系的荧光强度。测试条件为：激发狭缝宽度为20.0 nm，发射狭缝为10.0 nm，激发波长为481 nm，发射波长扫描范围为500～750 nm。

2 结果与讨论

2.1 CdSe/CdS QDs的光谱特性

图1为CdSe/CdS QDs的透射电镜(TEM)、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)和荧光光谱。由图1a可观察到CdSe/CdS QDs呈近似球形，且粒径分布较均匀，平均粒径约为3.0 nm。由图1b可见，CdSe/CdS QDs 的UV-Vis吸收峰位于515 nm处，依据紫外吸收光谱经验公式[19]：D=(9.812 7×10-7)λ3-(1.714 7×10-3)λ2+1.006 1λ-194.84(其中D为粒径，λ为最大紫外吸收波长)，计算得CdSe/CdS QDs的粒径为2.6 nm，与TEM表征结果较吻合。由图1c可见，激发波长为481 nm时，CdSe/CdS QDs的荧光峰位于580 nm，峰形尖锐、平滑且对称，半峰宽较窄(约为40.0 nm)，表明CdSe/CdS QDs的发光性能好，表面平滑缺陷少，且分散均匀。

2.2 测定原理

在中性的HAc-NaAc缓冲溶液中，CdSe/CdS QDs表面的TGA小部分(为0.04%)以—OOH形式存在，大部分(99.96%)以—OO-形式存在，因此其表面的TGA带有大量—OO-，QDs之间表面电荷产生的排斥作用使其能够以稳定的粒径形态存在；而在弱酸性(pH 5.6)条件下，TGA因质子化作用恢复成巯基基团进而破坏了Cd2+-TGA-QDs结构，使得TGA从CdSe/CdS QDs表面脱落[20-21]。同时，CdSe/CdS QDs表面裸露增加，团聚增多，导致CdSe/CdS QDs的荧光强度有所减弱。Wang等[22]研究表明，酸性条件下三聚氰胺可显著增强CdS QDs的荧光强度，推测是由于三聚氰胺中的氨基可与CdS QDs表面的Cd存在配位作用，进而占据TGA电离形成的空位，不利于CdS QDs团聚所致。元晓云等[12]发现链霉素中的氨基也可以占据CdTe QDs上TGA脱落形成的空位，使得CdTe QDs分散，荧光显著增强。Cyr的结构中也具有氨基官能团，使其可与CdSe/CdS QDs表面上的Cd发生配位作用，不利于CdSe/CdS QDs的团聚，进而能够增强CdSe/CdS QDs的荧光强度。

2.3 CdSe/CdS QDs浓度的选择

在体系pH 5.6条件下，考察了CdSe/CdS QDs浓度(0.01～10 mmol/L)对含50 nmol/L Cyr的蔬菜基质匹配溶液荧光强度的影响。结果显示，当CdSe/CdS QDs的浓度大于5.0 mmol/L时，溶液体系的荧光强度过强，若Cyr浓度较低(5.0～50 nmol/L)时，相对荧光强度变化较小，使得检测灵敏度低；当CdSe/CdS QDs的浓度低于0.05 mmol/L时，溶液体系的荧光强度较低，极少量的目标物即可使溶液体系的荧光强度显著变化，检测灵敏度提高，但线性范围变窄。而CdSe/CdS QDs的浓度在0.1～1.0 mmol/L范围内可获得较好的灵敏度和线性范围，进一步研究发现当浓度为0.5 mmol/L时，可使线性范围跨越2个数量级，检出限亦达到最佳。因此，后续实验选用0.5 mmol/L的CdSe/CdS QDs。

图2 溶液体系pH值对Cyr增强CdSe/CdS QDs荧光强度的影响Fig.2 Effect of pH value in solution on fluorescence enhancement of CdSe/CdS QDs in the presence of Cyr concentration of CdSe/CdS QDs：0.5 mmol/L;concentration of Cyr：50 nmol/L;reaction time:8.0 min

2.4 pH值的影响

在CdSe/CdS QDs、Cyr的浓度分别为0.5 mmol/L、50 nmol/L条件下，考察了HAc-NaAc溶液体系pH值(3.6～8.0)对Cyr增强CdSe/CdS QDs荧光强度的影响。由图2可知，当体系pH≤5.0或者≥6.0时，荧光强度变化很小；在pH 5.2～5.6范围时，Cyr的加入使得CdSe/CdS QDs的荧光强度显著增强，在pH 5.6时达到最大。因此，后续实验选择pH 5.6的缓冲溶液。

2.5 反应时间的影响

在上述优化条件下，于1.0～28 min范围内每隔1.0 min测定1次溶液体系的荧光强度变化。结果表明，体系的荧光强度变化值在1.0～8.0 min内逐渐增加，8.0 min达到最大，此后随着时间的增加基本保持不变。因此，选择最佳反应时间为8.0 min。

2.6 共存物质的影响

图3 辣椒中CdSe/CdS QDs随Cyr浓度变化的荧光光谱图Fig.3 Fluorescence spectra of CdSe/CdS QDs varied with concentration of Cyr in pepperconcentration of Cyr(1-6):20,40,60,80,100,110 nmol/L;pH 5.6

2.7 线性范围与检出限

在优化条件下，考察了不同蔬菜基质中CdSe/CdS QDs荧光强度与Cyr浓度之间的关系(见表1)。结果表明，不同蔬菜基质中Cyr的浓度(c)均在5.0～120 nmol/L范围内与CdSe/CdS QDs的荧光强度增强(F/F0)呈线性关系，相关系数(r)均不小于0.999 1。其中，辣椒中CdSe/CdS QDs随Cyr浓度变化的荧光光谱图见图3。分别以空白基质的3、10倍标准偏差除以基质匹配标准曲线的斜率，得到检出限(LOD)、定量下限(LOQ)分别为0.8～1.4 nmol/L、2.4～4.6 nmol/L。

表1 所建方法的线性关系、检出限与定量下限Table 1 Linear relations,detection limits and quantitation limits of the established method

2.8 方法比较

因蔬菜的基质背景荧光峰高于600 nm，本实验观察到蔬菜基质对CdSe/CdS QDs的荧光光谱几乎无影响(p>0.05)。相比于Cyr的其他检测方法，本方法通过荧光探针的荧光增强方式对Cyr进行选择性识别，具有线性范围宽、检出限低的优势(见表2)。

表2 本方法与Cyr常用检测方法的比较Table 2 Comparison of common methods with this method for determination of Cyr

*obtained by conversion for convenient comparison

2.9 回收率实验及实际样品的测定

为评价方法的准确度和精密度，向辣椒、豇豆、苦瓜、黄瓜和圣女果空白提取液中加入一定量的Cyr标准溶液，按本方法进行4、40、100 μg/kg 3个浓度水平的加标回收实验。结果如表3所示，Cyr的回收率为82.5%～108%，相对标准偏差(RSD)不大于6.9%，表明该方法具有较好的准确度和精密度。

采用本方法对海口市琼山区东门市场销售的蔬菜及澄迈县永灵村种植地的蔬菜各15个样品进行了检测，市售的5种蔬菜中均未检出Cyr，但在种植地采集的豇豆、辣椒中检出Cyr，其残留量分别为0.096～0.105、0.231～0.470 mg/kg，其中辣椒中残留量较高，但均未超过GB 2763-2016[5]规定的MRL值。

表3 所建方法的回收率与相对标准偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of the established method(n=3)

3 结 论

本文以TGA作为稳定剂制备CdSe/CdS QDs，基于Cyr可增强CdSe/CdS QDs荧光信号的特性，建立了一种测定蔬菜中Cyr含量的荧光探针法。结果表明，Cyr的检出限为0.8～1.4 nmol/L，定量下限为2.4～4.6 nmol/L，回收率为82.5%～108%，RSD不大于6.9%。该方法灵敏度高、操作简单、选择性好，能够用于实际蔬菜样品中Cyr的检测。