肺积汤对Lewis 肺癌裸鼠移植瘤新生血管的影响

张丽婷 刘贤忠 宋 康 陈 芳

肺积汤是国家级名老中医、浙江省中医院宋康教授治疗肺癌的基础经验方，临床多加减应用于肺癌的治疗，每每取得良效。为进一步确定其疗效及起效机制，本研究采用Lewis 肺癌小鼠模型观察肺积汤的抑瘤作用，及其对移植瘤血管生成的影响。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF 级4～6 周龄、体质量（20±2）g BALB/c 雄性裸鼠30 只（购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK2013-0016）；饲养于浙江中医药大学动物实验中心，温度（23±1）℃，湿度50%～60%，光照时间12h 光/12h 暗，水和饲料无限制供应。

1.2 细胞株 鼠源性Lewis 肺癌VEGF 高表达细胞株（山东省医学科学院提供）。

1.3 药物及配置 肺积汤（龙葵、蛇莓各9g，半边莲、半枝莲、蛇舌草各30g），购于浙江省中医院，由浙江中医药大学中药制剂室制成流浸膏，含生药1g/mL。按《医学实验动物学》计算小鼠等效用药剂量[1]（20g小鼠与60kg 成人的换算系数为12.33）。

1.4 主要试剂及仪器 免疫组化VEGF-A 检测盒（美国protein 公司，批号19003-1-AP）；VEGF-A ELISA 试剂盒（美国R&D Systems 公司，批号MMV00）；MICROM HM340E 石蜡切片机（德国MICROM 公司）；Leica HI120 型摊片机（德国LEICA公司）；Leica DMLB2 型显微镜摄像机（德国LEICA公司）。

2 实验方法

2.1 造模 复苏转染绿色荧光的裸鼠Lewis 肺癌细胞株，培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，连续传代3～4代至对数生长期后，用0.25%胰蛋白酶消化，1000rpm/min 离心5min 去上清，计细胞数，用PBS 稀释至2×106/mL 细胞浓度0.2mL/只，分别接种于裸鼠左侧腋下。接种后第5 天左侧腋下可及大小均一的肿块即造模成功。

2.2 药物干预 造模成功后应用随机数字表法将30 只裸鼠随机分为生理盐水组、肺积汤组和贝伐单抗组，每组10 只。生理盐水组裸鼠给予0.9%生理盐水0.4mL/只，灌胃，1 天1 次；肺积汤组裸鼠给予肺积汤混悬液（生药含量1g/mL）按22.2mg·kg-1，调整至0.4mL/只，灌胃，1 天1 次；贝伐单抗组给予贝伐单抗15mg·kg-1，调整至0.2mL/只，腹腔注射，1 周2 次，持续用药21 天。

2.3 标本获取 给药结束后，予10%水合氯醛（0.3mL/100g）皮下注射，摘左侧眼球取血1.5～2mL，冰上静置、离心取上清液分装，于-20℃冰箱中保存。采血结束后，分离皮下瘤，取两侧肺组织，4%多聚甲醛浸泡固定24h，HE 染色及免疫组化检测。

2.4 观察指标

2.4.1 一般情况 全程记录各组裸鼠精神状态、活动度、体质量、皮下瘤大小、皮脂等动态变化。肿瘤体积计算公式：肿瘤长径（A）和垂直横径（B），按公式V=A×B2/2 计算肿瘤体积。

2.4.2 病理切片 标本浸泡于4%多聚甲醛中，置于-20℃冰箱，24h 后取材固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片贴片、行HE 染色，树胶封片，镜下观察。

2.4.3 免疫组化 石蜡切片常规脱蜡，抗原修复，3%双氧水室温孵育，PBS 冲洗，10%血清封闭，严格按照说明书操作，加一抗，PBS 冲洗，加二抗，PBS 冲洗，滴加链霉卵白素工作液，PBS 冲洗，DAB 显色，苏木精复染，中性树胶封片。显微镜下观察、拍照。分别测定血管内皮生长因子-A（VEGF-A）的表达，计数微血管密度（MVD）。VEGF-A 蛋白染色棕色为阳性提示。MVD 的计数原则参照文献[2]。

2.4.4 酶联免疫吸附剂测定（ELISA）常温解冻冰冻血清、组织上清液标本，操作步骤严格按照试剂盒说明书执行，按采集的数据得出标准曲线，计算各自的OD 值。

2.5 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件进行统计分析，计量资料均以（±s）表示，符合正态性和方差齐性多样本均数的两两比较采用单因素方差分析，方差齐时用LSD 或SNK 法，方差不齐时数据组间比较用Dunnett’s 法，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组瘤体积、瘤重比较 与生理盐水组比较，肺积汤组荷瘤裸鼠，皮下瘤生长缓慢，体积小，无明显溃破坏死，皮肤褶皱、活动力下降等恶病质程度均较生理盐水组及贝伐单抗组轻，解剖后观察皮下瘤与周围组织粘连少，测得瘤重及体积为贝伐单抗组最小，肺积汤组次之，生理盐水组最大。见表1。

表1 各组瘤体积、瘤重（±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与肺积汤组比较，△P＜0.05；生理盐水组：0.9%生理盐水0.4mL/d 灌胃；肺积汤组：22.2mg·kg-1·d-1 肺积汤灌胃；贝伐单抗组：贝伐单抗15mg·kg-1 腹腔注射，1 周2 次

3.2 皮下瘤病理切片 生理盐水组大鼠皮下移植瘤胞核固缩坏死最多，形态不规则，排列紊乱，并可见较多散乱红细胞，间接反映血管渗透性较高，肺积汤组和贝伐单抗组差异不大，见插页图1。

3.3 各组瘤组织微血管密度比较 CD34 单克隆抗体标记下测定瘤体微血管密度，见生理盐水组皮下移植瘤微血管密度明显高于其他两组，且血管形态紊乱，分布不匀，增生明显。贝伐单抗组血管数量较肺积汤组少，多短粗直（见插页图2）。各组MVD IOD 值比较，肺积汤组及贝伐单抗组较生理盐水组明显降低，贝伐单抗组与肺积汤组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图2 各组皮下瘤CD34-MVD 表达（二步法染色×200）

表2 各组瘤组织MVD、VEGF-A 及血清VEGF-A 水平比较（±s）

表2 各组瘤组织MVD、VEGF-A 及血清VEGF-A 水平比较（±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；MVD：微血管密度；VEGFA：血管内皮生长因子-A；IOD：平均光密度；生理盐水组：0.9%生理盐水0.4mL/d 灌胃；肺积汤组：22.2mg·kg-1·d-1 肺积汤灌胃；贝伐单抗组：贝伐单抗15mg·kg-1 腹腔注射，1 周2 次

3.4 各组瘤组织及血清VEGF-A 表达量比较 免疫组化结果显示，肺积汤组及贝伐单抗组皮下瘤VEGF-A 表达明显低于生理盐水组。半定量数据结果证实，肺积汤组及贝伐单抗组瘤组织VEGF-A 表达量明显低于生理盐水组（P＜0.01），但肺积汤组与贝伐单抗组两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。ELISA 法检测结果显示，肺积汤组及贝伐单抗组血清VEGF-A 水平均低于生理盐水组（P＜0.05，P＜0.01），贝伐单抗组血清VEGF-A 水平虽低于肺积汤组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2，插页图3。

图3 各组皮下瘤血管内皮生长因子-A 表达（二步法染色×200）

4 讨论

血管新生是影响肿瘤发生、侵袭和转移等恶性生物学行为的重要因素之一，肿瘤的微血管密度被认为是反应肿瘤血管生成情况的理想指标[3-4]。VEGFA 是血管内皮生长因子家族中最常见的一员，是已知的血管生成蛋白中作用最直接的可溶性促内皮细胞分裂素，通过与受体结合促进血管内皮增殖而促进肿瘤血管生成[5-6]。而贝伐单抗为最经典的抗VEGF药物。

宋康认为，正虚邪实是肺癌的辨证总纲，热毒是肺癌最主要的致病邪气，热毒、瘀血、痰湿互结，损伤络脉，使邪毒流注他处是肺癌形成及转移的病理基础，具有“浓、黏、凝、聚”的特点。治疗肺癌，清热解毒澄其源、活血化瘀通其络、利水消肿消其瘤当根据患者的体质贯穿始终[7]。肺积汤由龙葵、蛇莓、半边莲、半枝莲、白花蛇舌草组成，具有清热解毒、活血化瘀、利水消肿之效。君药龙葵、蛇莓取意于治疗膀胱癌方剂“龙蛇羊泉汤”。中医认为，肺主行水，为水之上源，体内水道上始于肺，下终于膀胱，下焦闭则上焦塞，治下亦可疗上。诚如《脏腑疏凿论》云：“肺与膀胱相通，肺病宜清利膀胱水。”清代唐宗海在《中西医汇通医经精义·脏腑通治》亦指出：“肺与膀胱相隔其远，而实相通，肺病则水停为痰饮，故宜清利膀胱以泻之[8]。”研究证实，“龙蛇羊泉汤”可直接抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡，增加小鼠机体抗氧化的能力[9]。龙葵碱已被证实可抑制血管内皮生长因子的表达[10]。蛇莓可通过抑制细胞增殖，激发细胞凋亡和失巢凋亡，抑制上皮-间质转化和血管生成；并可改善免疫功能[11]。半枝莲含多种活性化学成分，可通过抗炎、抑制肿瘤血管生成等过程发挥多靶点、多通路的协同抗肿瘤作用[12-13]。章尤权等[14]证实，白花蛇舌草通过调控PI3K/Akt 信号通路的相关蛋白抑制肿瘤血管新生。

本研究观察到，以贝伐单抗作为阳性对照，荷瘤裸鼠经肺积汤干预治疗后，皮下瘤生长减慢，恶病质情况较生理盐水组及贝伐单抗组均减轻。皮下瘤坏死、血管数量少，形态相对较规则、无癌栓形成。研究结果还显示，肺积汤组皮下瘤组织MVD、VEGF-A表达均较生理盐水组低（P＜0.05，P＜0.01）；与贝伐单抗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。总之，本研究结果证实肺积汤能抑制皮下瘤，可能与其下调组织及血清VEGF-A，维持血管稳态，降低血管通透性，减少肿瘤血管新生，降低微血管密度，抑制肿瘤的生长和转移有关。